Микология

Микология Для дачи

Как повысить эффективность бактериоскопической диагностики микозов стоп?

Микозы стоп (МС) — инфекционные заболевания кожи и ногтей, требующие обязательного лабораторного подтверждения клинического диагноза. Среди возбудителей МС преобладают дерматомицеты: Trichophyton rubrum и Trichophyton mentagrophytes [1, 2]. T. rubrum за последние 15 лет в России верифицировался у больных МС в 65,7—92% случаев, в странах СНГ — в 93,6% [3—7]. В европейских странах соотношение T. mentagrophytes/T. rubrum составляет 1:10 [8, 9]. В Москве в 2005—2022 гг. в структуре дерматофитий в целом доля дерматофитии стоп (ДС) составила 82% [10].

Реформирование российского здравоохранения затронуло и микологическую службу. Основными методами диагностики МС по-прежнему считают бактериоскопический и бактериологический (культуральный). Централизация бактериологических лабораторий привела к значительному сокращению посевов для диагностики М.С. Врачи в своей практической деятельности зачастую используют только бактериоскопический метод.

В большинстве случаев материал с очагов поражения на коже берется для исследования путем соскоба скальпелем или предметным стеклом. Реже используют метод скотч-проб [11, 12]. Кусочки ногтей отрезают бритвой, маникюрными ножницами или кусачками. Место забора материала при онихомикозах напрямую зависит от формы заболевания, но всегда ногтевую пластинку следует срезать с захватом всей ее толщины, а исследуемый кусок ногтя должен находиться как можно дальше от свободного края. При выраженном подногтевом гиперкератозе роговые массы извлекают выскабливанием их из-под ногтевой пластинки. Материал направляют в лабораторию в бумажных пакетах из темной бумаги или в сухих закрытых микропробирках.

Микроскопическое исследование на грибы выполняют в нативных и окрашенных препаратах. Выделяют прямую (исследование патологического материала) и непрямую (исследование культуры гриба) микроскопию. Для прямой микроскопии готовят нативные препараты путем измельчения и заливки патологического материала 10—30% раствором щелочи (КОН или NaОН). Этот процесс называют мацерацией патологического материала [11]. Прямая микроскопия в практической деятельности врача обладает рядом преимуществ: простота исполнения, экономичность (нет необходимости использовать дорогостоящее обору-дование), быстрое подтверждение клинического диагноза, своевременное начало лечения и решение вопроса о выборе среды для культуральной диагностики. Чувствительность КОН-теста составляет 83,9% [11].

Для просветления препаратов можно использовать 10% раствор дисульфида натрия в этаноле, хлораллактофенол по Аману, лактофенол [13]. Сочетание КОН с димексидом нарушает структуру гриба [11]. При микроскопии препаратов можно получить как ложноотрицательные, так и ложноположительные результаты. Это зависит от качества взятия материала, сроков его хранения и особенностей транспортировки [11, 14—16]. Положительные результаты микроскопической диагностики подтверждаются культуральным методом в 28—60% случаев [17].

В НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашкина разработан и внедрен в практику метод микроскопии нативных препаратов с окраской калькофлюором белым — флюорохромным красителем, имеющим сродство к хитину и целлюлозе. При его смешивании с КОН в препарате происходит поглощение красителя фрагментами гриба [18]. При люминесцентной микроскопии видно зеленое свечение гифов, дрожжевых клеток, псевдомицелия. Краска флюоресцирует в ультрафиолетовом свете. Обнаружение грибов увеличивается на 10% по сравнению с КОН-тестом. Однако этот метод можно использовать только в лабораториях, где имеется флюоресцентный микроскоп с набором фильтров.

При ДС для взятия патологического материала можно использовать метод скотч-проб. Его эффективность при ДС изучена А.П. Малярчуком в 2022 г. [12]. Для этой цели прозрачный скотч размером с предметное стекло многократно с усилием прикладывают к очагу поражения до потери липкости (8—10 раз). Кусочки ногтя, обрывки пузырей приклеивают к скотчу, который помещают на предметное стекло с 30% раствором щелочи с глицерином липкой стороной книзу. Скотч заменяет покровное стекло. Препарат, приготовленный из тонких чешуек кожи, микроскопируют через 20—30 мин. Кусочки ногтя, обрывки пузырей помещают в щелочь на нес-колько часов. Приготовленный препарат может храниться несколько часов и даже суток.

В ходе выполнения кафедральной научно-исследовательской работы «Проблемы инфекционной патологии кожи», одной из задач которой было определить частоту ДС у больных, госпитализированных в стационары многопрофильного лечебного учреждения, возникла необходимость в совершенствовании бактериоскопического метода диагностики. Медико-экономические стандарты регламентируют сроки пребывания больных в стационаре, а обследование и лечение проводится только с учетом профильного для отделения диагноза (Приказ Министерства здравоохранения РФ от 29 декабря 2022 г. № 1706). Для разработки алгоритма дерматологического сопровождения больного с ДС, протекающей на фоне сопутствующей соматической патологии, потребовалось быстрое и эффективное подтверждение диагноза микотической инфекции.

Цель исследования: усовершенствовать метод бактериоскопической диагностики ДС и сравнить его эффективность с традиционным методом и методом скотч-проб.

Диагностика ДС осуществлялась бактериоскопическим методом. Результат считали положительным при обнаружении нитей истинного септированного мицелия.

В стационарах многопрофильного лечебного учреждения обследованы 402 больных. Методами бактериоскопической диагностики ДС выявлены у 221 (54,9%) пациента. Использованы методы: традиционный (n=34), скотч-проб (n=44) и щелочное препарирование (ЩП) в шприце (авторский, n=51) и все три метода одновременно у одного пациента (n=92). На каждого больного с лабораторно подтвержденным диагнозом ДС заполняли унифицированную индивидуальную регистрационную карту «Клинико-эпидемиологические особенности ДС у больных в стационарах». Статистическая обработка материала проведена методами описательной и аналитической статистики, позволяющей определить различия между значениями показателей в выборках (р<0,05).

На первом этапе исследования у 34 (15,4%) больных был использован традиционный метод забора материала. Сразу был отмечен ряд недостатков для его применения у больных в соматических стационарах:

1. Отсутствие специального помещения для забора материала. Процедура выполнялась в палате и нередко вызывала негативную реакцию со стороны других больных. В связи с этим необходимо было за минимальный срок получить достаточное количество материала.

2. Обычно препарат для микроскопии готовится на предметном стекле с использованием 10, 20, 30% раствора КОН. Щелочь быстро кристаллизуется, что сильно затрудняет процесс микроскопии, в связи с этим препарат обычно просматривается однократно после короткого времени экспозиции в щелочи.

3. Транспортировка материала в лабораторию и его подготовка к микроскопии обычно занимают 1—3 дня и зависят от организационных моментов и характера материала (кожа или ногти). За время исследования некоторые больные выписывались из стационара, результат исследования не попадал в выписной эпикриз и в лучшем случае сообщался пациенту по телефону или электронной почте. Кроме того, при перемещении патологического материала из пробирки/пакета на предметное стекло происходили его частичная потеря и рассеивание в помещении. В соответствии с этим был оптимизирован метод забора материала и процесс его подготовки к микроскопии.

На втором этапе у 44 (19,9%) больных забор материала с пораженных участков кожи стоп осуществляли методом скотч-проб, который в эпидемиологическом плане менее опасен для пациентов, находящихся в одной палате с больным. Однако он был не совсем удобен для исследования кусочков ногтевых пластинок. При их неравномерном растворении в щелочи толщина препарата была различной, что создавало трудности при микроскопии.

С учетом высокой частоты поражения ногтевых пластинок, наличия выраженного гиперкератоза (что требует более длительного растворения патологического материала в щелочи) предложен метод, названный нами щелочным препарированием (ЩП) в шприце.

Описание метода. Материал для исследования с очагов поражения на стопах (соскобы чешуек, мацерированного эпидермиса, обрывки покрышек пузырей, фрагменты гиперкератоза с кожи и из-под ногтей и т. д.) помещают в шприц (5 мл) после извлечения из него поршня. Затем вставляют поршень в шприц, плотно прижимая материал.

Для просветления и растворения патологического материала готовят специальный состав: КОН 30 г, глицерин 10 мл и дистиллированная вода до 100 мл. Через иглу в шприц набирают небольшое количество этого раствора, обычно 0, 5—1 мл. Патологический материал должен быть полностью погружен в жидкость. Время экспозиции зависит от плотности материала, взятого для исследования, и соответствует времени, которое необходимо для его растворения. Оно определяется визуально при периодическом встряхивании шприца. Затем иглу снимают и 1—3 капли взвеси из шприца помещают на предметное стекло, накрывают покровным стеклом, прижимают для равномерного распределения взвеси, удаляют вытекающую из-под стекла лишнюю щелочь (промакивают). Микроскопируют под малым (ув. 10), затем средним (ув. 40) увеличением микроскопа. При отрицательном результате выполняют повторную микроскопию оставшегося в шприце материала.

Метод ЩП в шприце был применен нами у 51 (23,1%) больного. Недостатки, имевшие место при традиционном методе и методе скотч-проб, были устранены.

Четвертый этап исследования был посвящен сравнительному анализу эффективности трех перечисленных выше методов у 92 (41,6%) больных. Для этого у каждого пациента брали материал одновременно тремя методами. Онихомикоз имели 78 (84,8%) больных.

Сравнительный анализ эффективности трех методов лабораторной диагностики (традиционный, скотч-проб, ЩП в шприце) соскобов эпидермиса у 92 больных ДС отражен в табл. 1.

Микология
Таблица 1. Сравнительный анализ эффективности различных методов лабораторной диагностики при исследовании соскобов эпидермиса у больных с ДС (n=92) Примечание. * — зависело от топики процесса (подошвы, межпальцевые складки, боковая поверхность стоп и т. д.); ** — проводилось до получения положительного результата.

Наибольшее число положительных результатов зарегистрировано при использовании метода ЩП в шприце (91,1%). Традиционным методом диагноз подтверждали в 1,5 раза реже (60,9%; р<0, 05), методом скотч-проб — в 1,3 раза реже (68,5%; р<0,05). Достоверных отличий при сравнении последних двух методов не выявлено (p>0,05).

Определенный интерес представляла оценка эффективности трех рассматриваемых методов диагностики при различных клинических формах Д.С. Для получения достоверных статистических данных в одну группу объединены больные со сквамозной и сквамозной интертригинозной формами (n=48), в другую — с изолированной интертригинозной, дисгидротической формами и их сочетанием (n=19).

При сквамозной форме ДС (рис. 1)

Микология
Рис. 1. Формы Д.С.: сквамозная (а); сквамозная интертригинозная (б).

наилучшие результаты показали методы скотч-проб (91,6%) и ЩП в шприце (95,8%) (рис. 2).

Микология
Рис. 2. Сравнительный анализ эффективности бактериоскопической диагностики ДС различными методами с учетом клинических форм заболевания (n=92).

Положительный результат при использовании традиционного метода зарегистрирован в 66,7% случаев. При сквамозно-гиперкератотической форме (рис. 3)

Микология
Рис. 3. Сквамозно-гиперкератотическая форма ДС.

эффективность методов распределялась в следующей последовательности: ЩП в шприце (96%), скотч-проб (80%) и традиционный (44%). При вариантах ДС, протекающей с наличием экссудативных морфологических элементов и эрозий (дисгидротическая, интертригинозная и их сочетание), метод скотч-проб был менее эффективным (21,1%) (рис. 4, 5).

Микология
Рис. 4. Интертригинозная форма ДС.
Микология
Рис. 5. Дисгидротическая форма ДС.

Традиционный метод и метод ЩП в шприце по эффективности практически не отличались (78,9 и 73,7% соответственно).

Сравнительный анализ эффективности двух методов лабораторной диагностики (традиционный и ЩП в шприце) срезов ногтевых пластинок у 65 больных ДС отражен в табл. 2.

Микология
Таблица 2. Сравнительный анализ эффективности двух методов лабораторной диагностики при исследовании срезов ногтевых пластинок у больных с ДС (n=65)

Метод ЩП в шприце оказался в 1,4 раза эффективнее (70,8% против 50,7%; р<0,05). Результаты исследования напрямую зависели от толщины ногтевых пластинок. При нормотрофическом и гипертрофическом типах, но с минимальным гиперкератозом ногтевых пластинок оба метода давали положительный результат. При выраженном подногтевом гиперкератозе преимущество было у метода ЩП в шприце.

На рис. 6 представлены

Микология
Рис. 6. Эффективность метода ЩП в шприце (посуточно).

данные об эффективности метода ЩП в шприце при исследовании соскобов эпидермиса и фрагментов ногтевых пластинок с учетом сроков растворения патологического материала в щелочи. Из 82 больных с ДС при положительном результате исследования методом ЩП в шприце диагноз в 1-е сутки был подтвержден в 85,5% случаев. На 2-е сутки возбудитель был обнаружен еще у 9,7% больных, на 3-и — еще у 14,8%. При исследовании срезов ногтевых пластинок на 2-е сутки число положительных результатов было в 1,7 раза больше (56,5% против 32,6%; р<0,05). На 3-и сутки еще у 10,9% больных обнаружены нити мицелия.

Результаты исследования наглядно свидетельствуют о преимуществе метода ЩП в шприце. При минимальных затратах получен оптимальный результат.

Сравнительный анализ двух методов лабораторной диагностики при ДС отражен в табл. 3.

Микология
Таблица 3. Преимущества методов скотч-проб и ЩП в шприце при ДС

Для бактериоскопической диагностики патологического материала при ДС разработана новая методика ЩП в шприце. Ее эффективность при исследовании соскобов эпидермиса (91,1%) в 1,5 раза выше, чем при традиционном методе (60,9%; р<0,05), и в 1,3 раза выше, чем при методе скотч-проб (68,5%; р<0,05). При исследовании срезов ногтевых пластинок новая методика в 1,4 раза эффективнее традиционного метода (70,8 и 50,7%; р<0,05). Число положительных результатов при всех методах бактериоскопической диагностики зависит от клинической фор-мы ДС и максимально при использовании метода ЩП в шприце. Эффективность последнего метода возрастает посуточно, особенно при исследовании срезов ногтевых пластинок.

Список сокращений

Дерматофитии стоп — ДС

Микозы стоп — МС

Щелочное препарирование — ЩП

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflict of interest.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Т.В. Соколова, А.П. Малярчук

Подбор литературы — А.П. Малярчук, К.В. Монтес Росель

Работа с больными, сбор и обработка материала — К.В. Монтес Росель

Подготовка иллюстраций — Т.В. Соколова, А.П. Малярчук, К.В. Монтес Росель

Написание текста — Т.В. Соколова, К.В. Монтес Росель

Редактирование — А.П. Малярчук

Authors’ contributions:

The concept and design of the study — T.V. Sokolova, A.P. Malyarchuk,

Selection of literature — A.P. Malyarchuk, K.V. Montes Rosel

Working with patients, collecting and interpreting the data — K.V. Montes Rosel

Preparation of illustrations — T.V. Sokolova, A.P. Malyarchuk, K.V. Montes Rosel

Drafting the manuscript — T.V. Sokolova, K.V. Montes Rosel,

Revising the manuscript — A.P. Malyarchuk

Сведения об авторах

Малярчук А.П. — https://orcid.org/0000-0003-2559-846X

Монтес Росель К.В. — https://orcid.org/0000-0002-8480-4297

Соколова Т.В. — https://orcid.org/0000-0002-5450-4218

КАК ЦИТИРОВАТЬ:

Малярчук А.П., Монтес Росель К.В., Соколова Т.В. Как повысить эффективность бактериоскопической диагностики микозов стоп? Клиническая дерматология и венерология. 2022;18(4):-435. https://doi.org/10.17116/klinderma202218041

Микология

Инфекционные заболевания человека, вызываемые грибами, носят общее название микозы. Этиология, патогенез и клиническая картина микозов чрезвычайно разнообразны, однако практически во всех случаях этих заболеваний в патологический процесс вовлекается кожа.

Грибковые заболевания (микозы) кожи характеризуются поражением кожи и ее придатков (волос, ногтей), реже микоз локализуется на слизистых оболочках полости рта и половых органов (изолированно или наряду с кожными изменениями). Казуистическими в нашей стране являются случаи глубоких микозов, вызываемых эндемичными для некоторых регионов мира грибами, при которых поражаются подкожная клетчатка и другие глубокие ткани. В последние годы возросло количество системных диссеминированных микозов, при которых также, как правило, наблюдается поражение кожи. В этих случаях возбудители чаще всего попадают в кожу вследствие гематогенного распространения из внутренних органов. Кожные высыпания в этих случаях могут быть первым симптомом системного микоза и их ранняя правильная диагностика позволяет своевременно назначить лечение и во многих случаях спасти жизнь больного.

Подавляющее большинство патогенных и условно-патогенных грибов вызывают заболевание только при наличии факторов, снижающих нормальную физиологическую защитную функцию кожи и нарушающих резистентность организма против инфекции (особенно при иммунодефицитных состояниях). Количество этих причин в последнее время резко возросло (неблагоприятные экологические факторы; увеличение количества больных со злокачественными болезнями, особенно иммунной системы; ВИЧ-инфекция; широкое использование медицинских препаратов, обладающих иммуносупрессивным свойством: цитостатиков, гормонов, антибиотиков и т. д.). Все это, в свою очередь, приводит не только к увеличению числа больных с обычными микозами кожи но и к появлению необычно протекающих, атипичных оппортунистических грибковых инфекций. С другой стороны, в последние годы разработаны и внедрены в клиническую практику высокоэффективные противогрибковые препараты, позволяющие при правильной диагностике, с учетом патогенеза болезни, успешно излечивать больных с различными, даже тяжелыми формами микозов. 

Грибы (Fungi) представляют собой эукариотные гетеротрофные, спорообразующие организмы, не имеющие хлорофилла. Примерно 98% всех относимых к грибам организмов составляют царство Fungi (настоящие грибы), равнозначное царствам Plantae (растения) и Animalia (животные).

От растений, водорослей, цианобактерий (сине-зеленых водорослей), единственным источником углерода и энергии для которых является углекислый газ и солнечный свет, грибы отличаются своей гетеротрофностью (греч. heteros иной trophie пища), т. е. неспособностью к образованию питательных веществ с помощью фотосинтеза. От прокариотных бактерий грибы отличаются наличием истинного ядра, а от простейших и животных – клеточной стенки.

Гетеротрофность грибов заключается в том, что они поглощают готовые питательные вещества из окружающей среды. По образу жизни различают две группы грибов: сапробионты (сапротрофы, сапрофиты), получающие необходимые им соединения углерода из органических остатков, и биотрофы (симбионты, паразиты), использующие в качестве партнеров или хозяев растения, водоросли, животных, простейших, бактерии и другие грибы.

Царство Fungi состоит приблизительно из 120000 описанных в литературе видов, репродуктивные структуры которых полностью лишены приспособлений к активной локомоции. На основании важнейших признаков половых стадий, грибы разделяются на три отдела: Zygomycota, Ascomycota и Basidiomycota. Настоящие грибы, известные только бесполым спороношением, т. е. с неполным или неполно описанным развитием, включены в формальный отдел «несовершенных» грибов (Fungi imperfecti или Deuteromycota) [Мюллер Э., Леффлер В., 1995].

Грибы осуществляют значительную часть постоянно происходящих в природе превращений, которые играют существенную жизненно важную роль для всех организмов, обитающих на земле. Традиционно значение грибов оценивается с точки зрения их «пользы» или «вреда» для человека. Это антропоморфное деление грибов на полезные и вредные во многих случаях носит чрезвычайно условный характер. Так, например, спорынья Claviceps purpurea, с одной стороны, является чрезвычайно патогенной для ржи и других злаковых и ядовита для человека, с другой стороны, этим грибом заражают целые поля для получения склероций («рожков») спорыньи, являющихся источником алкалоидов, широко Применяемых в гинекологической практике (при атонии матки и связанных с нею маточных кровотечениях). Грибы дерматофиты являются возбудителями основной группы грибковых заболеваний кожи человека, что обусловлено избирательной способностью этих грибов поражать роговой слой эпидермиса, волосы, ногти (кератинофилия). С этой точки зрения дермафиты, несомненно, вредны для человека. В природе, однако, эти грибы разлагают и утилизируют кератин птиц (перья) и животных (шерсть, копыта), санируя таким образом окружающую природу.

Человек использует грибы во многих сферах своей деятельности. С глубокой древности съедобные грибы употребляют в качестве продуктов питания, ферментирующие дрожжи применяют в хлебопечении, сыроварении, винокурении и пивоварении. Биосинтетические особенности грибов используют для получения антибиотиков (пенициллина, гризеофульвина, цефалоспорина и др.), каротиноидов, лимонной кислоты и т. д. Перспективно использование грибов для уничтожения отходов, например, бытового мусора (рециклизации). Разведение на мусоре съедобных грибов и кормовых дрожжей является экологически безопасным и эффективным методом рециклизации, альтернативным широко используемым сжиганию или захоронению. Вредное действие грибов также весьма многообразно. Заселение грибами всех доступных субстратов неизбежно ведет к повреждению природных продуктов. Грибы вызывают гниение плодов, портят молоко, мясо, рыбу, разрушают древесину, шерсть, лен, хлопок и т. п. Они вызывают болезни растений, животных и человека.

Различают три основных типа прямого поражения человека грибами: токсическое (мицетизм, микотоксикоз), сенсибилизирующее (микогенная аллергия) и инфекционное (развитие микозов кожи и других органов).

Токсическое действие грибов.
1. Мицетизм – отравление первично ядовитыми грибами при их случайном использовании в качестве продуктов питания, а также съедобными грибами при их неправильном хранении либо приготовлении. Мицетизм обусловлен действием токсических пептидов грибов на пищеварительную, нервную системы или менее специфичным поражением клеток и тканей тела.
2. Микотоксикозы – отравление ядовитыми веществами токсинообразующих грибов, загрязняющих растения (например, злаковые), из которых приготавливаются продукты питания. Ядовитые вещества, продуцируемые этими грибами, сохраняют свои токсические свойства в период хранения урожая и при переработке растений в продукты питания. Употребление этих продуктов может быть причиной отравления человека.

Микогенная сенсибилизация. Многие грибы являются причиной специфической сенсибилизации организма человека, которая проявляется своеобразными аллергическими формами болезни и выявляется различными аллергическими реакциями. Микогенная сенсибилизация может проявляться общими симптомами (например, типа сенной лихорадки) или кожными сыпями (микидами).

Инфекционное значение грибов. Известно около 50 видов грибов, способных всегда вызывать инфекционные заболевания у человека и животных: 20 видов являются причиной системных инфекций, 10 – поражают кожу и подкожную клетчатку и 20 – только кожу. Гораздо большее количество видов относится к патогенным и условно-патогенным возбудителям, вызывающим микозы только при наличии определенных условий, снижающих резистентность организма к инфекции (чаще всего при иммунодефицитных состояниях).

Наиболее патогенными грибами являются возбудители особо опасных, высококонтагиозных инфекций (кокцидиоидоза, гистоплазмоза, североамериканского бластомикоза и др.). Эти заболевания, как правило, носят эндемический характер. Так, кокцидиоидоз чаще всего регистрируют в странах Центральной Америки, Мексике, Аргентине; гистоплазмоз, вызываемый Histoplasma capsulatum, — в странах Карибского бассейна, Северной, Центральной и Южной Америки; гистоплазмоз, вызываемый Histoplasma dubosii, эндемичен для Западной и Центральной Африки; риноспоридоз – для Индии и Цейлона; североамериканский бластомикоз (болезнь Джилкрайста) и южноамериканский бластомикоз – для стран, указанных в названиях болезней.

Условно-патогенные грибы вызывают так называемые оппортунистические грибковые инфекции. Для их развития необходимы серьезные нарушения общей резистентности, особенно иммунного статуса организма. В последние годы значение условно-патогенных грибов и вызываемых ими оппортунистических микозов резко возросло в связи с ВИЧ-инфекцией. Условно-патогенные грибы встречаются среди аспергиллов и пенициллов, мукоровых и дрожжеподобных грибов рода Candida, а также среди возбудителей различных мицетом [Аравийский Р. А., Горшкова Г. И., 1995].

Самыми распространенными грибами, вызывающими при определенных условиях заболевания кожи и ее придатков (волос, ногтей), являются дерматофиты. 

Выделяют две фазы онтогенетического развития грибов: вегетативную и репродуктивную. Непосредственно после прорастания вегетативное тело гриба (таллом) состоит из нерасчлененного протопласта или сходных друг с другом, окруженных клеточной стенкой единиц (гиф), которые питаются и размножаются автономно. Репродуктивная фаза характеризуется функциональной дифференцировкой и размножением гриба с появлением большинства таксономически значимых признаков.

Таллом гриба (греч. thallos побег, росток – слоевище – тело низших растений, водорослей, грибов и др., не расчлененное на стебель и листья) состоит из гиф или почкующихся клеток. Характерные для подавляющего большинства грибов гифы (греч. hyphe – ткань), нитчатые вегетативные органы гриба, совокупность которых называют мицелием (грибницей, греч. my cos – гриб), можно отличить от других типов таллома уже вскоре после прорастания. Диаметр гиф варьирует в зависимости от вида гриба и внешних условий от 2 мкм до 100 мкм и более; у дерматофитов – от 1 до 6 мкм. Наиболее короткий мицелий наблюдается у дрожжей, наиболее длинный – мукоровых грибов. У высших грибов мицелий септирован (разделен поперечными перегородками). В септированных гифах клетки расположены одна за другой в один ряд. Молодой мицелий – более тонкий гомогенный и светлый, зрелый – более зернистый в связи с наличием в нем различных включений; старый мицелий представляется сильно вакуолизированным и грубозернистым. Мицелий гриба постоянно ветвится. Диаметр мицелия может быть различным в одной и той же культуре: то более широким, то более узким – диморфизм мицелия.

Весьма разнообразными являются окончания ветвей мицелия у дерматофитов, что используется для определения некоторых видов грибов. У одних грибов они могут быть закручены в виде завитков и спиралей; у других заканчиваться ровными или волнистыми побегами; у третьих иметь весьма характерные ветвления в виде «гребешковых органов», «канделябров», «рогов северного оленя» и т. п.

Почкующиеся клетки характерны для дрожжевых и дрожжеподобных грибов. Почкование клеток как способ роста и размножения макроскопически выражается, как правило, в слизистой консистенции колоний на твердом субстрате, а микроскопически – в форме и расположении отдельных клеток. Процесс почкования начинается с выпячивания клеточной стенки или ее внутреннего слоя (слоев). Через проростковую пору выходит часть протопласта материнской клетки с (дочерним) ядром, изредка – с несколькими ядрами. Дочерняя клетка дорастает до размера материнской. Затем «перешеек» между ними перешнуровывается за счет поперечной перегородки. В зрелом состоянии почкующиеся клетки одинаковы по форме, размеру, окраске, типу почкования. У некоторых, обычно почкующихся грибов, например, Candida albicans, может наблюдаться переход от почкования к росту гиф. Этот переход происходит в микроаэрофильных условиях через промежуточную стадию псевдогиф, т. е. удлинения клеток, которые либо продолжают почковаться, либо за счет образования септ превращаются в настоящие гифы и при определенных обстоятельствах дают боковые ответвления. У грибов рода Candida переход от почкования к росту гиф, как правило, свидетельствует об усилении патогенности. 

Клетки грибов могут иметь самый различный облик, но все они сходны между собой набором основных структур, особенно на уровне клеточных органелл. К этим органеллам относятся: клеточное ядро, митохондрии, рибосомы, элементарные мембраны, клеточная стенка, микросомы и подобные им органеллы и др.

Клеточное ядро – содержит в себе важнейшую наследственную информацию и передает ее дальше. Его основной компонент – хромосомы, которых всегда несколько (в бактериальной клетке хромосома одна); их генетическая функция определяется дезоксирибонуклеиновой кислотой (ДНК). Кроме того, в ядре имеются нуклеоплазма и чаще всего одно ядрышко.

Митохондрии содержат ферменты дыхательной цепи, окислительного фосфорилирования и цикла лимонной кислоты.

Рибосомы – органеллы синтеза белка. Основной компонент рибосом – РНК – образуется на ядерной ДНК и вместе с белками накапливается в ядрышке или ядерном колпачке. В цитоплазме часть рибосом располагаются беспорядочно, однако большинство их прикреплено к мембранам эндоплазматического ретикулума, митохондриям, другим органеллам или частицам.

Элементарные мембраны. К ним относятся: эндоплазматический ретикулум – сеть двойных ламелл (элементарных мембран), трубочек и шаровидных частиц. Основные компоненты представлены липидами, белками, липопротеинами. Система эндоплазматического ретикулума служит для внутриклеточного транспорта веществ и образует почти все поверхности раздела в цитоплазме.

Микросомы и подобные им органеллы рассматривают как проявление адаптивных ферментативных возможностей гриба.

Клеточная стенка, как правило, содержит хитин, маннан, глюканы; другие вещества, в частности целлюлоза, встречаются лишь изредка. Будучи самостроящейся, постоянно расширяющейся и изменяющейся по мере роста и развития структурой, клеточная стенка является экскреторной органеллой, относящейся к так называемой параплазме, однако может содержать ферменты и другие высокоактивные вещества. Общее понятие «антигены клеточной стенки» отражает важные серологические свойства грибковой клетки, которые, как и прочие свойства ее стенки, меняются в зависимости от стадии жизненного цикла. 

Размножение грибов происходит половым (совершенные грибы) и неполовым (несовершенные грибы) путем. Оно может быть вегетативным и репродуктивным. Вегетативное размножение происходит без специальных или с помощью малоспециализированных органов. Репродуктивное размножение осуществляется при помощи специальных органов воспроизведения.

Механизмы размножения грибов весьма разнообразны: деление, прорастание, почкование клеток и спорообразование.

Для вегетативной фазы развития грибов характерно бесполое размножение и образование особых органов, обеспечивающих рост таллома. В этот период увеличение биомассы гриба происходите основном за счет деления, прорастания и почкования. Образуются особые органы, обеспечивающие прорастание гриба, поселение на хозяине, заражение и разрастание, увеличение биомассы.

Деление происходит за счет удлинения тела клетки и образования ниточки мицелия, которая делится поперечно, на оболочке появляются перетяжки и молодые клетки отделяются одна от другой.

Прорастание является частой формой размножения. Оно обеспечивает развитие мицелиальной основы гриба (грибницы) и проявляется в виде выпячивания (росток) стенки протопласта соответствующих клеток по ходу или по бокам мицелия. Достигнув соответствующих размеров, росток отграничивается перегородкой от материнской клетки и продолжает развиваться, обеспечивая формирование грибницы.

Почкование осуществляется за счет образования на поверхности клетки небольшого выпячивания, в которое поступает часть протоплазмы и ядро материнской клетки — образуется почка, которая затем отделяется и превращается в самостоятельную клетку. В результате почкования образуются скопления округлых, дрожжеподобных клеток, которые при малом увеличении микроскопа напоминают шары или гранулы. Этот вид размножения характерен для дрожжеподобных грибов рода Candida.

Для поселения на хозяине грибы образуют особые органы прикрепления (апрессории, гифоподии и т. п.). У дерматофитов образуются перфорирующие органы, представляющие собой многоклеточные образования, выполняющие несколько функций: прикрепление к субстрату, внедрение в него (в кожу, волосы, ногти) и поглощение питательных веществ. При внедрении в клетки эпидермиса и прорастании через внутренние клеточные стенки хозяина паразитические грибы, как правило, образуют специфические, чаще всего очень тонкие, инфекционные и перфорационные гифы. 

Основной функцией этой фазы является выживание и распространение грибов при остановке роста колонии и отмирании вегетативных частей таллома. Эта функция обеспечивается бесполым и половым спороношением.

Бесполые репродуктивные структуры (анаморфы). Бесполыми считаются репродуктивные структуры, формирующиеся без смены ядерных фаз за счет простого преобразования мицелия или его частей.

Образующиеся бесполым путем споры выполняют две основные функции: сохранение гриба в неблагоприятных условиях и его распространение в окружающей среде. Структурами, обеспечивающими грибу переживание в неблагоприятных условиях внешней среды, являются хламидоспоры, склереции и сходные структуры переживания. К образующимся бесполым путем спорам, служащим для распространения гриба, относятся конидии, а также формирующие и несущие их органы (спорангии, конидиеносцы, фиалиды, плодовые тела и т. д.). Некоторые структуры выполняют сразу обе функции, причем хламидоспоры и конидии могут быть морфологически неразличимы. Хламидоспоры представляют собой толстостенные клетки или соответствующие им многоклеточные образования (мелкие комплексы клеток, функционирующие как одно целое). Они переживают отмирание и разложение вегетативного таллома и после достаточного периода времени пассивно высвобождаются в среду (в отличие от конидий, которые вскоре после своего формирования отделяются от материнской гифы или несущего их органа и служат для распространения). Хламидоспоры могут быть концевыми (терминальными) или промежуточными (интеркалярными). Конидии – это органы распространения, характерные для высших грибов. Они могут быть одно- или многоклеточными, просто или сложноустроенными; бесцветными, темными или окрашенными; возникают чаще всего на гифообразных конидиеносцах, находящихся на поверхности сложных репродуктивных органов. Конидиеносцы проводят питательные вещества из субстратных гиф в развивающиеся конидии и обеспечивают их высвобождение и рассеивание.

Различают два вида конидий: таллические, или артритические, и бластические.

1. Таллические (артритические) конидии (таллоконидии, артроконидии, ранее называвшиеся также таллоспорами, оидиями, а у дерматофитов – алевриоспорами) формируются путем последовательного септирования и расчленения уже существующих гиф. Конидии представляют собой зрелые наружные споры, образующиеся на концевых ветвях или по бокам мицелия; они имеют вид гомогенных, круглых, овальных, реже с заостренными концами небольших клеток. Форма и расположение их весьма характерны для различных грибов и используются в качестве признака их определения (микро- и макроконидии, оидии, гемиспоры, алейрии и т. д.). Наиболее частая форма спорообразования, наблюдаемая у дерматофитов в культуре и патологическом материале (коже, волосах, ногтях), — артроспоры. Полагают, что обнаружение артроспор в пораженной коже, волосах и ногтях является диагностическим признаком дерматофитов.

2. Бластические конидии (бластоконидии) образуются почкованием зрелой нити. Путем почкования могут возникать простые, причудливые, септированные или темноокрашенные бластоконидии. Путем почкования образуются хламидоспоры у Candida albicans.

Половые спороношения (телеморфы). Половое размножение служит для распространения индивидуального штамма и переживания неблагоприятных условий, оно также способствует генетической стабилизации видов. Примерно у 70% грибов в цикле развития есть половая фаза, которая предусматривает плазмогамию, половую копуляцию, кариогамию, мейоз и, как правило, образование мейоспор. Между этими кардинальными пунктами гриб может расти вегетативно, увеличивать свою биомассу, накапливать энергию и обычно размножаться бесполовым путем. Циклы развития — отличительный признак таксонов грибов. 

Химический состав и обмен веществ у грибов мало чем отличаются от других микроорганизмов. Он определяется наследственностью (таксономическая составляющая) и окружающей средой (рективная составляющая). Протекающие в грибах биохимические процессы разделяют на «первичный обмен веществ» и «вторичный обмен веществ» [Мюллер Э., Леффлер В., 1995]. Первичный обмен веществ связан с вегетативным развитием гриба (трофофазой) и заключается в синтезе макромолекул и липидов (увеличение биомассы), получении энергии и строительного материала для обмена веществ. В этот период мицелий на большом протяжении контактирует с субстратом, и каждая вегетативная единица питается самостоятельно. Поглощение и расходование питательных веществ взаимно уравновешены. Грибная масса регулярно увеличивается. Позже, по мере накопления метаболитов, истощения среды и прочих изменений условий регуляция метаболизма нарушается и происходит переход к «вторичному обмену веществ» (идиофаза). Грибы образуют воздушный мицелий, существование которого зависит от транспорта веществ внутри таллома. Физиологически это проявляется появлением множества вторичных метаболитов, которые находятся в клетках, выделяются в среду или используются грибами в новых, продолжающих меняться условиях.

Основными компонентами грибковой клетки, активно действующей в обмене веществ, являются макромолекулы (нуклеиновые кислоты, белки, полисахариды), фосфолипиды и элементарные мембраны.

Дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК). Клетки грибов содержат в 2,5 — 10 раз больше ДНК, чем бактериальные, но в 200 — 300 раз меньше, чем растительные и животные клетки. Основной функцией ДНК является хранение генетической информации, определяющей обязательную последовательность важнейших превращений.

Рибонуклеиновые кислоты (РНК). В клетках гриба имеются три типа РНК — рибосомная (рРНК), матричная (мРНК) и транспортная (тРНК). Все они синтезируются на ДНК (транскрипция) и участвуют в синтезе белка (трансляция). Реакции синтеза белка на рибосомах лежат в основе многих механизмов регуляции обмена веществ. На эти чувствительные участки обмена веществ действуют многочисленные антибиотики. Так, механизм фунгистатического действия противогрибкового антибиотика гризеофульвина объясняют его связыванием с РНК дерматофитов.

В клетках грибов имеются два основных типа белков: ферменты и склеропротеины.

А. Ферменты. Ферменты грибов разнообразны как по своему происхождению, так и по активности. В грибах имеются экзогенные и эндогенные ферменты. Экзогенные ферменты (экзоферменты), например целлюлазы и протеазы, выделяются клеткой гриба во внешнюю среду, причем позднее сама клетка может поглощать продукты осуществленного экзоферментами разложения субстрата. Большинство ферментов локализуются внутри клетки гриба (эндоферменты). Различают конститутивные ферменты, действующие постоянно, и адаптивные ферменты, синтезирующиеся по мере необходимости (например, целлюлаза образуется только в присутствии целлюлозы как субстрата).

Основная группа ферментов используется грибами для получения питательных веществ. Внутри своих клеток все грибы разлагают и синтезируют макромолекулы, используя для этого сходный набор гомологичных ферментов. Грибы потребляют, кроме того, почти все встречающиеся в природе органические соединения, включая сложные и нерастворимые субстраты с помощью экзоферментов; растворимые продукты разложения поглощаются их клетками и претерпевают в них дальнейшие превращения.

Протеолитические ферменты. Очень многие грибы способны к экзогенному расщеплению белков. Выделяют два основных типа протеолитических ферментов: эндопептидазы и экзопептидазы (карбоксипептидазы и аминопептидазы). Дерматофиты, относящиеся к группе кератинофильных грибов, имеют фермент кератиназу и способны успешно разлагать такие трудно усвояемые белки, как кератины кожи, волос, ногтей, перьев, когтей и т. п.

Липолитические ферменты используются грибами для расщепления жиров на глицерин и жирные кислоты, которые в дальнейшем включаются в обмен веществ. Возбудитель отрубевидного лишая (Pityrosporum orbiculare) обладает выраженной липолитической активностью, что иногда может быть причиной системных поражений (у недоношенных грудных детей при искусственном вскармливании интралипидами).

Ферменты, разлагающие полисахариды (целлюлазы, мальтоза, сахароза и т. д.), принимают активное участие в углеводном обмене веществ. Широко распространенные ферменты грибов гидролизу ют крахмал, пектины и гемицеллюлозы. Особенно выражена эта активность у грибов рода Candida.

Б. Склеропротеины (скелетные, опорные или структурные белки) представляют собой составные (полисахаридные) элементы клеточных стенок, определяющие их строение.

Присутствуют в основном в клеточных стенках грибов. Представлены как гомополисахаридами из одинаковых мономеров (целлюлаза, хитин, глюкомананны, аглюкан и т. д.), так и гетерополисахаридами (например, глюкомананны некоторых дрожжей). 

Элементарные мембраны входят в состав эндоплазматического ретикулума, система которого служит для внутриклеточного транспорта веществ и образует почти все поверхности раздела в цитоплазме. Мембраны содержат много липидов, среди которых фосфолипиды (например лецитин) своими амфолитическими свойствами определяют сам принцип построения мембран. Мембраны представляют собой особенно чувствительную мишень для разнообразных ингибиторов. Многочисленные антибиотики, фунгициды и дезинфицирующие средства имеют точкой своего приложения именно мембраны. Полиеновые антибиотики (амфотерицин В и др.) нуждаются в качестве акцепторов в определенных стероидах мембраны, в результате чего нарушается ее проницаемость и клетка теряет жизненно необходимые вещества. Невосприимчивость бактерий к полиеновым антибиотикам объясняют отсутствием в их мембранах стероидов, которые имеются практически у всех грибов. Противогрибковые средства из группы азолов ингибируют биосинтез эргостерина мембран и таким образом нарушают их функцию. 

Углеводный обмен

играет важную роль в жизнедеятельности грибов. Моносахариды и другие низкомолекулярные соединения углерода являются важнейшей и легко усвояемой пищей грибов. Грибы быстрее, чем другие микроорганизмы, поглощают и ассимилируют различные углеводы.

Аминокислотный обмен. Грибы синтезируют аминокислоты из простых соединений углерода и азота. Аминокислоты используются ими для синтеза белков, витаминов (например, пантотеновой кислоты), нуклеотидов и алкалоидов, получения других аминокислот и энергии.

Витамины. Грибы нуждаются в поступлении витаминов извне (ауксотрофность), но и сами способны синтезировать некоторые витамины (прототрофность). Грибы не нуждаются в жирорастворимых витаминах и аскорбиновой кислоте.

Микроэлементы. Грибам, как и прочим микроорганизмам, необходимы очень малые количества некоторых неорганических компонентов питательной среды. Важнейшие из них – ионы тяжелых металлов. Недостаток микроэлементов ограничивает рост и активность грибов, а их высокие концентрации часто токсичны. 

Вторичный метаболизм характерен для репродуктивной фазы развития грибов. Он отражает индивидуальные особенности грибного таксона. Образующиеся в процессе вторичного метаболизма продукты специфичны для продуцирующего их штамма, вида или рода гриба; они могут вызывать дифференцировку таллома. Различные вторичные метаболиты (антибиотики, микотоксины) могут действовать на другие организмы.

К вторичным метаболитам относятся половые гормоны, микоспорины, пигменты, антибиотики, микотоксины. Так, например, из примерно 3200 известных антибиотиков 772 (около 24%) синтезируются грибами (пенициллин, цефалоспорин С, гризеофульвин и др.). Микотоксин афлатоксин, попадая в организм человека или животного с зараженной грибами пищей, оказывает канцерогенное, тератогенное, мутагенное действие и нарушает иммунные реакции. 

Грибы – чрезвычайно богатая видами группа представителей живых существ. К настоящему времени описаны и названы 110 — 120 тысяч их видов, однако признается, что их не меньше, чем семенных растений, т. е. 250 — 500 тысяч видов. В среднем ежегодно описывают более 1000 новых видов. Полагают также, что на самом деле видовое богатство грибов втрое-вчетверо больше, чем цветковых растений [Мюллер Э., Леффлер В., 1995].

Распространение грибов зависит от особенностей их роста и спороношения, а также от факторов, выполняющих роль их пассивного переноса: воздуха (анемохория), воды (гидрохория), животных (зоохория) и человека (антропохория). В современных условиях особое значение в рассеивании грибов приобрел антропохорный способ, обусловленный массовым перемещением людей и товаров.

Большинство грибов являются космополитами, реже они обнаруживаются в ограниченных, длительное время неизменных ареалах (эндемизм).

Присутствие грибов на различных объектах внешней среды может быть бессимптомным или сопровождаться различными признаками. Первыми признаками сапрофитного роста грибов могут быть изменения субстрата (например, образование спирта дрожжами, гниль древесины и т. п.); реже первым становится видимым сам грибной таллом (например, при его появлении в прозрачной воде). Грибковые инфекции растений, животных и человека в течение более или менее длительного периода времени, а в случаях «эндосимбиотического заселения» — всегда, остаются бессимптомными. (Эдо)паразитический рост гриба в зависимости от обстоятельств проявляется в виде определенных симптомов (нарушений роста, изменений окраски, увядания у растений; кожных высыпаний, лихорадки, зуда у человека; выкидышей, маститов и т. п. у животных).

Устойчивость грибов к воздействию неблагоприятных факторов внешней среды весьма различна; она зависит как от вида гриба, так и от условий его существования. Грибы лучше противостоят вредным влияниям физических, химических и биологических факторов в живом организме, чем в культурах. Роговые пластинки волоса, ногтя, перьев и т. п. предохраняют грибы от вредных воздействий. В тканях больного человека возникают различные формы сохранения грибов, например, сферулы, а также развиваются тканевые изменения (клеточные гранулемы, некротические массы, скопления лейкоцитов и т. п.), препятствующие проникновению в клетки гриба вредных веществ. Чувствительность грибов к химическим агентам различна. Они достаточно устойчивы к минеральным кислотам (серной, соляной, азотной). В 5% растворах соляной и серной кислот дерматофиты погибают в течение 45 — 60 мин, в азотной кислоте еще быстрее. 1 — 2% растворы салициловой и бензойной кислоты убивают грибы через 10 — 15 мин в культуре и через 30 — 40 мин в патологическом материале (волосах, чешуйках кожи, ногтях). Растворы 60 — 70% этилового спирта приводят к гибели грибов в волосе и чешуйке через 30 — 40 мин. Выраженным фунгицидным свойством обладают 5% раствор фенола, 10% раствор формалина, 5% раствор хлорной извести, лизола, гипохлорида натрия. Фунгистатическим действием обладают соответствующие растворы уротропина, перекиси водорода, борной кислоты, тимола, нафтола, ментола, йода, протаргола. Активными фунгистатическими веществами являются спиртовые растворы (1:50000 — 1:100000) различных анилиновых красителей (фуксина, генциан- и метилвиолета, малахитового зеленого, метилового голубого). 

Ботанические классификации подразделяют грибы на роды и виды, которые в свою очередь распределяются в различных семействах, подклассах и классах. По способу размножения грибы подразделяются на 8 классов (аскомицеты, хитридомицеты, гифохитридомицеты, оомицеты, трихомицеты, зигомицеты, базидиомицеты и дейтеромицеты). Медицинское значение в качестве возбудителей болезней из них имеют только четыре: аскомицеты, зигомицеты, базидиомицеты и дейтеромицеты (несовершенные грибы, fungi imperfecti).

Класс аскомицетов (Ascomycetes) включает в себя наиболее многочисленную группу патогенных для человека и животных грибов (различные виды дерматофитов, дрожжеподобные и плесневые грибы); класс зигомицетов (Zygomycetes) представлен патогенными для человека видами родов Mucor, Rhizopus, Absidia, Basidiobolus; к классу базидиомицетов (Basidiomycetes) относится возбудитель менингоэнцефалита Cryptococcus neoformans. Класс дейтеромицетов (Deuteromycetes, син. Fungi imperfecti – несовершенные грибы) включает в себя возбудителей микозов, в цикле развития которых неизвестны стадии полового размножения.

Основную роль в этиологии грибковых заболеваний, особенно кожи, играют три группы возбудителей: дерматофиты, дрожжеподобные грибы и плесени.

Среди дерматофитов наиболее распространенными являются грибы рода Trichophyton (виды Т. rubrum, Т. mentagrophytes,T. schonleinii,T. verrucosum,T. tonsurans,T. violaceum); Microsporum (M. cams, M. audouinii, M. ferrugineum) и Epidermophyton (E. floccosum).

Основными условно-патогенными возбудителями заболеваний кожи и слизистых оболочек являются грибы рода Candida, преимущественно С. albicans, реже другие виды (С. tropicalis, С. pseudotropicalis, С. krusei, С. parapsilosis и др.); меньшее значение имеют виды Pityrosporum и Torulopsis.

Из огромного количества плесневых грибов только несколько видов могут быть причиной микозов кожи: Ехорhialia werneckii, вызывающая черный лишай (Tinea nigra), и Piedraia horta, являющаяся причиной черной пьедры.

Источник: https://sinref.ru/  

Прецизионная диагностика инвазивных микозов нелегка.

Это объясняется не только трудностями в получении культуры грибов, но и в интерпретации результатов исследований, поскольку грибами, как дрожжевыми, так и мицелиальными, возможны колонизация слизистых оболочек, контаминация исследуемых образцов. В связи с этим диагностика инвазивных микозов базируется на комплексном подходе, включающем не только результаты микологических (культуральных) и серологических (определение антигена грибов) исследований, но и клинические симптомы грибковой инфекции, данные вспомогательных методов исследований (компьютерная или магнитно-резонансная томография, ультразвуковое исследование).

Европейско-американской кооперированной группой по изучению инвазивных микозов у иммунокомпрометированных больных разработаны критерии диагностики инвазивных микозов. Они представлены в 2001 г. на Международной конференции по антимикробным препаратам и химиотерапии (ICAAC, Chicago), а в 2002 г. в печати. Определены критерии доказанного, вероятного и возможного инвазивного микоза, которые рекомендуется использовать при клинических и эпидемиологических исследованиях.

Доказанный инвазивный микоз, вызванный мицелиальными грибами: обнаружение мицелия грибов в биоптатах либо аспиратах при гистологическом или цитологическом исследовании или выделение культуры из образцов, полученных в асептических условиях из стерильного в норме очага, который по результатам клинического и радиологического исследований связан с инфекцией, за исключением исследований мочи и со слизистых оболочек.

Доказанный инвазивный микоз, вызванный дрожжевыми грибами: обнаружение дрожжевых клеток (грибы рода Candida могут формировать псевдомицелий или истинный мицелий) в биоптатах или аспиратах, за исключением образцов со слизистых оболочек, или выделение культуры из образцов, полученных в асептических условиях из стерильного в норме очага, который по результатам клинического и радиологического исследований связан с инфекцией, за исключением исследований мочи, образцов из пазух носа и со слизистых оболочек, или обнаружение при микроскопии и специфическом окрашивании (в капле туши, окраска муцикармином) дрожжевых клеток либо положительного антигена Cryptococcus spp. в цереброспинальной жидкости.

Фунгемия, обусловленная мицелиальными грибами: выделение гемокультуры грибов, за исключением Aspergillus spp. и Penicillium spp., включая Penicillium marneffei, в сочетании с клиническими симптомами инфекционного процесса, совместимыми с выделенным возбудителем.

Фунгемия, обусловленная дрожжевыми грибами: выделение гемокультуры грибов рода Candida или иных дрожжевых грибов у пациентов с клиническими признаками инфекции, связанными с данным возбудителем.

Исследуемый биоматериалПоказания, используемые среды, значение
КровьПоказания:
стойкая лихорадка (4—5 дней и более) на фоне терапии антибиотиками широкого спектра действия; вторая «волна» лихорадки на фоне терапии антибиотиками
Исследования:
Забор крови из вены во флаконы для аэробных бактерий* или в селективную среду для грибов, неоднократный (2—3 раза в течение суток с интервалом 1 ч)
Диагностическая значимость:
выделение дрожжевых грибов, осторожная интерпретация при выделении мицелиальных грибов, за исключением Fusarium spp.
Венозный катетерПоказания:
выделение дрожжевых грибов из крови Центральный или периферический венозный катетер удаляют во всех случаях выделения дрожжевых грибов из крови
Исследования:
Для микологического исследования используют асептически удаленный дистальный отрезок катетера длиной 5— 6 см. Исследование проводят полуколичественным (Maki method) или количественным методом на среде Сабуро
Диагностическая значимость:
выделение дрожжевых грибов при полуколичественном исследовании 15 КОЕ или более, при количественном — 103КОЕ/мл или более для подтверждения диагноза катетерассоциированной инфекции или инфицирования катетера
Отделяемое верхних дыхательных путей, мокрота, смывы из трахеи, бронхов, жидкость бронхоальвеолярного лаважаПоказания:
подозрение на микозы, вызванные мицелиальными грибами или Cryptococcus neoformans; длительная лихорадка на фоне терапии антибиотиками широкого спектра действия и нейтропении Исследования:
Микроскопия образцов с калькофлуором белым (обнаружение мицелия или псевдомицелия); посев на среду Сабуро; определение антигена Aspergillus в жидкости бронхоальвеолярного лаважа при наличии очагов в легких, характерных для инвазивного аспергиллеза
Диагностическая значимость:
выделение мицелиальных грибов или Cryptococcus neoformans
Цереброспинальная жидкостьПоказания:
симптомы менингита; обнаружение очага (очагов) в головном мозге при компьютерной или магнитно-резонансной томографии; «мозговая» симптоматика на фоне лихорадки и нейтропении Исследования:
Микроскопия с калькофлуором белым, в капле туши; определение антигена Aspergillus, Cryptococcus; посев на среду Сабуро
Диагностическая значимость:
обнаружение грибов как дрожжевых, так и мицелиальных; положительный антиген
Биоптаты, аспираты, перитонеальная жидкость, плевральная жидкостьПоказания:
клинические и/или радиологические признаки инвазивного микоза; лихорадка на фоне терапии антибиотиками широкого спектра действия.
Исследования:
Микроскопия с калькофлуором белым, посев на среду Сабуро
Диагностическая значимость:
обнаружение грибов как дрожжевых, так и мицелиальных

Частота выделения грибов из крови идентична при исходном взятии крови как во флаконы со средой для культивирования бактерий, так и с селективной средой для грибов.

Вероятный инвазивный микоз диагностируют при совокупности следующих критериев:
• наличие хотя бы одного фактора риска, индуцирующего развитие инвазивного микоза;
• один признак из категории микробиологических критериев;
• один признак из категории «значимых» или два из группы «менее значимых» клинических симптомов инфекционного процесса.

Возможный инвазивный микоз диагностируют на основании совокупности следующих критериев:
• наличие хотя бы одного фактора риска, индуцирующего развитие инвазивного микоза;
• один признак из категории микробиологических критериев или один признак из категории «значимых» (два из группы «менее значимых») клинических симптомов инфекционного процесса.

Понятие «возможный инвазивный микоз» не рекомендуется использовать в клинических исследованиях по изучению эффективности протигрибковых препаратов. Можно пользоваться этим термином при анализе эмпирической противогрибковой терапии, эпидемиологических исследований, изучении фармакоэкономики.

При микологическом исследовании стерильных аспиратов или биоптатов принимают во внимание выделение не только культуры грибов, но и обнаружение при микроскопии мицелия или псевдомицелия. В гистологических препаратах аспергиллы трудно дифференцировать от Fusarium spp., Sceclosporium apiospermum и некоторых других мицелиальных грибов. Для дифференциальной диагностики следует проводить иммуногистохимическое исследование с антителами к аспергиллам.

Выделение дрожжевых грибов из крови хотя бы в одном исследовании относится к категории «доказанного» инвазивного микоза и является абсолютным показанием к назначению системных антимикотиков больным с нейтропенией. Частота выявления дрожжевых грибов из крови невысокая, даже при диссеминированном кандидозе она составляет 35—50 %.

Проведение повторных посевов крови повышает вероятность получения положительных результатов.

Иная интерпретация результатов в случае обнаружения мицелиальных грибов в крови. Высокая частота выделения мицелиальных грибов характерна для Fusarium spp. и составляет 40—60 %. Aspergillus обнаруживают крайне редко, в большинстве случаев это рассматривается как контаминация, за исключением Aspergillus terreus.

Выделение Aspergillus terreus из крови больных с гемобластозами может свидетельствовать об истинной аспергиллемии, а при наличии клинических симптомов инфекции является основанием для назначения антимикотиков.

ПоказательКритерии
Факторы, индуцирующие возникновение инвазивного микоза (макроорганизм)Нейтропения (< 0,5*109/л в течение 10 дней)
Персистирующая лихорадка в течение более 96 ч на фоне терапии антибиотиками широкого спектра действия
Температура тела выше 38 °С или ниже 36 °С и любой из следующих предрасполагающих признаков: длительная нейтропения (более 10 дней) в течение предыдущих 60 дней, интенсивная им-муносупрессивная терапия в течение последних 30 дней, доказанный или вероятный инвазивный микоз в предыдущий период нейтропении либо СПИД
Наличие симптомов РТПХ, прежде всего случаи тяжелого течения (II степени) или экстенсивное течение хронической болезни
Длительное (более 3 нед) применение глюкокортикоидов в течение последних 60 дней
Микробиологические признакиВыделение культуры мицелиальных грибов (включая Aspergillus spp., Fusaruim spp., Sceclosporium spp. и зигомицеты) и Cryptococcus neqformans из мокроты или жидкости бронхоальвеолярного лаважа
Положительные результаты культурального или цитологического исследования (прямой микроскопии) по обнаружению мицелиальных грибов из аспиратов придаточных пазух носа
Обнаружение мицелиальных грибов или Cryptococcus neoformans при цитологическом исследовании/ прямой микроскопии из мокроты или жидкости бронхоальвеолярного лаважа
Положительный антиген Aspergillus в жидкости бронхоальвеолярного лаважа, цереброспинальной жидкости и образцах крови (не менее двух)
Положительный антиген криптококка в образцах крови
Обнаружение при цитологическом исследовании или прямой микроскопии элементов грибов в образцах стерильных в норме жидкостей (например, Cryptococcus spp. в цереброспинальной жидкости)
Два положительных результата исследований по обнаружению культуры дрожжевых грибов в моче при отсутствии мочевого катетера Кристаллы Candida в моче при отсутствии мочевого катетера
Выделение Candida spp. из гемокультур
Клинические признаки Нижние дыхательные пути Признаки высокой степени значимости Признаки меньшей степени значимостиДолжны быть сопряжены с локусом, откуда берут образцы для микробиологического исследования
Любой из следующих типов новых инфильтратов в легких по данным КТ: симптом «ореола», симптом «полумесяца», полость с участками консолидации*
Симптомы инфекции нижних дыхательных путей (кашель, боль в грудной клетке, кровохарканье, диспноэ), шум трения плевры, любой новый инфильтрат, не включенный в признаки высокой степени значимости; плевральный выпот
Верхние дыхательные пути Признаки высокой степени значимости Признаки меньшей степени значимостиРадиологические признаки инвазивной инфекции в пазухах носа (эрозия стенки или распространение инфекции на прилежащие структуры, экстенсивная деструкция костей черепа)
Насморк, заложенность носа, изъязвления слизистой оболочки носа, носовое кровотечение, периорбитальный отек, боль в области верхней челюсти, некротические изъязвления черного цвета или перфорация твердого неба
Центральная нервная система Признаки высокой степени значимости Признаки меньшей степени значимостиРентгенологические признаки предполагаемой инфекции ЦНС (мастоидит или другой параменингеальный фокус, экстрадуральная эмпиема, множество очагов в веществе головного или спинного мозга)
Фокальные неврологические симптомы и признаки, включая фокальные судороги, гемипарез; расстройства сознания, менингеальные симптомы, нарушения биохимического состава цереброспинальной жидкости и ее клеточного состава (при отсутствии других возбудителей, по данным культурального исследования и микроскопии, при отсутствии опухолевых клеток)

*При отсутствии инфекции, обусловленной микроорганизмами, способными вызвать аналогичную радиологическую картину, включая образование полостей (Mycobacterium spp., Legionella spp., Nocardia spp.).

При выявлении в крови или иных стерильных биосубстратов дрожжевых грибов обязательно следует проводить идентификацию до вида и определять чувствительность к противогрибковым препаратам, при выделении мицелиальных (плесневых) грибов — только идентификацию до вида, чувствительность не определяют.

В клинической практике чувствительность мицелиальных грибов не исследуют по причине несовершенства стандартов по определению чувствительности таких грибов к антимикотикам. Более того, только в одном исследовании продемонстрирована корреляция между чувствительностью Aspergillus spp. и результатами лечения инвазивного аспергиллеза у больных с гемобластозами. Ни в одном из исследований, проведенных в последующем, не получено подобных результатов.

В последнее время стали появляться единичные сообщения о формировании приобретенной резистентности грибов A. fumigatus к итраконазолу, вориконазолу.

Идентификация грибов до вида, особенно полученных из стерильных локусов, необходима прежде всего для выбора антимикотика и проведения адекватной противогрибковой терапии. Так, Candida krusei устойчивы к флуконазолу и менее чувствительны, чем дрожжевые грибы другого вида, к амфотерицину В; Aspergillus terreus, Scedosporium apiospermum (Pseudallescheria boydii), Trichosporon beigelii, Scopulariopsis spp. резистентны к амфотерицину В; Mucorales резистентны к итраконазолу, вориконазолу, Candida glabrata проявляет дозозависимую чувствительность к флуконазолу, и при выделении этого вида гриба, даже чувствительных штаммов, дозу флуконазола следует увеличить (взрослым назначают 800 мг вместо 400 мг); Candida lusitaniae устойчивы к амфотерицину В.

На основании видовой идентификации грибов можно предположить инвазивный микоз или колонизацию грибами слизистых оболочек. Например, Aspergillus niger существенно реже, чем Aspergillus fumigatus, являются причиной инвазивного аспергиллеза у больных острыми лейкозами. Выделение из жидкости бронхоальвеолярного лаважа Aspergillus niger чаще всего расценивается как колонизация дыхательных путей, а из мокроты — как контаминация из воздуха и требует дополнительных исследований при подтверждении диагноза инвазивного аспергиллеза.

На основании выделения мицелиальных грибов из мокроты, бронхоальвеолярной жидкости, аспирата околоносовых пазух можно только предполагать инвазивный микоз, не включая его в категорию «доказанного». Тем не менее обнаружение Aspergillus в мокроте, особенно Aspergillus fumigatus или Aspergillus flavus, у пациентов с нейтропенией, реципиентов аллогенного костного мозга всегда должно быть принято во внимание. Это требует повторного проведения микологического исследования и компьютерной томографии легких. Так, при нейтропении вероятность выявления инвазивного аспергиллеза в случае положительной культуры Aspergillus spp. в мокроте составляет 80 %.

Выделение Cryptococcus neoformans у иммунокомпрометированных больных из респираторного тракта (смывы, лаваж) является диагностически значимым. Если идентификация дрожжевых грибов из жидкостей, полученных из дыхательных путей (смывы из трахеи, бронхов, бронхоальвеолярный лаваж) иммунокомпрометированных больных, не относится к обязательным исследованиям, то проведение скрининга по выявлению Cryptococcus neoformans из этих образцов является необходимым.

Обнаружение кандид в моче у больных с нейтропенией и лихорадкой, как правило, считается проявлением диссеминированной кандидозной инфекции.

В своевременной диагностике инвазивного аспергиллеза успешно пользуются коммерческим тестом по выявлению циркуляции специфического антигена грибов Aspergillus spp. галактоманна (полисахаридный водорастворимый компонент клеточной стенки гриба).

Галактоманн может быть определен двумя методами: методом латекс-агглютинации (Pastorex Aspergillus, фирмы BioRAD) и методом иммуноферментного анализа (Platelia Aspergillus, фирмы BioRAD).

Преимуществом иммуноферментного метода является более низкий порог чувствительности определения уровня галактоманна в крови — 1 нг/мл и менее, а с помощью латекс-агглютинации — 15 нг/мл. Диагностическое значение имеет определение галактоманна в крови (не менее чем в 2 образцах), цереброспинальной жидкости, бронхоальвеолярном лаваже. Чувствительность метода иммуноферментного анализа составляет около 90 %, специфичность 90—99 %, у реципиентов аллогенного костного мозга данные показатели ниже и равны соответственно 60—70 % и 80—90 % вследствие профилактического применения противогрибковых препаратов (антимикотики снижают пороговый уровень галактоманна).

В 40 % случаев выявление галактоманна в крови опережает проявления инвазивного аспергиллеза, определяемые при компьютерном исследовании легких, а в 70 % опережает клинические симптомы инфекции.

Диагностическую значимость тест по выявлению антигена Aspergillus имеет в том случае, если исследование проводят неоднократно. Определение антигена Aspergillus в крови следует проводить при лихорадке на фоне лечения антибиотиками широкого спектра действия у больных с нейтропенией 2 раза в неделю; при пневмониях, которые возникают или сохраняются на фоне антибактериальной терапии; при обнаружении очагов в легочной ткани (компьютерная томография).

Источник: MedUniver 

Посев на грибы родов candida, aspergillus, cryptococcus с подбором антимикотических препаратов для candida spp. (мазки различных локализаций)

Исследование, в ходе которого с помощью специальной питательной среды выявляют возбудителей грибковых инфекций (Candida spp., Aspergillus spp., Cryptococcus spp.).

В ходе исследования проводится идентификация видов грибка и подбор антимикотических препаратов для дальнейшего лечения.

Синонимы русские

  • Бакпосев на грибковые инфекции (Candida spp., Aspergillus spp., Cryptococcus spp.)
  • Бактериологический (культуральный) метод

Синонимы английские

  • Fungal culture (Candida spp., Aspergillus spp., Cryptococcus spp.)

Метод исследования

Микробиологический метод.

Какой биоматериал можно использовать для исследования?

Мазок из зева (ротоглотки), мазок с конъюнктивы, мазок из носа, мазок из носоглотки, мазок из носовых пазух, мазок урогенитальный, мазок урогенитальный (с секретом предстательной железы), мазок из уретры, мазок из цервикального канала, мазок с внутренней поверхности шейки матки (из цервикального канала), отделяемое абсцесса полости рта, отделяемое раны, отделяемое уха.

Как правильно подготовиться к исследованию?

  • За 3-4 часа до взятия мазков из ротоглотки (зева) не употреблять пищу, не пить, не чистить зубы, не полоскать рот/горло, не жевать жевательную резинку, не курить. За 3-4 часа до взятия мазков из носа не закапывать капли/спреи и не промывать нос. Взятие мазков оптимально выполнять утром, сразу после ночного сна.
  • Женщинам исследование (процедуру взятия урогенитального мазка) рекомендуется производить до менструации или через 2-3 дня после её окончания.
  • Мужчинам — не мочиться в течение 3 часов до взятия урогенитального мазка.
  • Не проводить туалет полости рта в день взятия биоматериала на исследование.

Общая информация об исследовании

Грибковые инфекции (микозы) – обширная группа инфекционных заболеваний человека, вызываемых дрожжевыми, плесневыми или диморфными грибами. Микозы можно разделить на поверхностные, при которых поражение ограничивается кожей и слизистыми оболочками (например, кандидозный стоматит), и глубокие (инвазивные), при которых могут поражаться практически любые внутренние органы, например легкие, головной мозг, клапаны сердца, почки, суставы. Наибольшую трудность представляет диагностика инвазивных микозов.

Наиболее часто возбудителями инвазивных микозов являются грибы Candida albicans (инвазивный кандидоз), Cryptococcus neoformans (криптококкоз) и Aspergillus fumigatus (инвазивный аспергиллез). Эти разные заболевания имеют много общего. Во-первых, риск развития любого из трех указанных микозов повышен у людей с иммуносупрессией, возникающей при ВИЧ-инфекции, после трансплантации органов и тканей или на фоне онкогематологических заболеваний. Во-вторых, эти микозы могут протекать практически одинаково и сопровождаться неспецифическими признаками локального и системного инфекционного процесса (лихорадка, слабость, кашель, боль в грудной клетке, головная боль). Поэтому провести дифференциальную диагностику этих инвазивных микозов между собой на основании только клинических симптомов невозможно. Основную роль в диагностике инвазивных микозов играют лабораторные методы.

Как правило, диагностика инвазивных микозов носит комплексный характер, однако посев (бактериологический, или культуральный, метод) на грибы по-прежнему остается «золотым стандартом» диагностики. Бакпосев выступает в роли подтверждающего теста, в то время как предварительная диагностика инвазивных микозов основывается на менее точных, но более «быстрых» лабораторных методах, например анализе на криптококковый антиген при подозрении на криптококкоз, обработке раствором гидроксида калия KOH при подозрении на кандидоз или методе ПЦР при подозрении на аспергиллез.

В ходе бактериологического исследования анализируемый биоматериал вносят в специальную питательную среду. Скорость роста колоний разных видов грибов несколько отличается. Так, рост Aspergillus spp. будет заметен уже через 48 часов, Cryptococcus spp. – через 48-72 часа, а грибам Candida albicans потребуется до 1 недели и более. Следует отметить, что чувствительность бактериологического метода зависит от характера биоматериала, используемого для исследования. Так, например, выделить культуру гриба из крови, даже в случае диссеминированной инфекции, удается нечасто (особенно при инфекции Aspergillus spp. или Candida spp.). Другой фактор, влияющий на точность результата теста, – это использование антимикотических препаратов до взятия биоматериала. Применение азолов, амфотерицина и эхинокандинов до взятия биоматериала на исследование может приводить к ложноотрицательному результату. Учитывая эти особенности, важно подчеркнуть, что отрицательный результат посева не всегда позволяет полностью исключить инвазивный микоз.

Характер биоматериала также следует учитывать и при интерпретации положительного результата. Нестерильные среды (мокрота, моча, смывы с бронхов) могут в норме содержать грибы, поэтому положительный результат исследования нестерильных сред не позволяет говорить о наличии инвазивного микоза. Так, Candida spp. и Aspergillus spp. являются условно-патогенной флорой дыхательных путей и могут быть выделены в культуре при посеве мокроты здоровых людей. Cryptococcus spp. не относятся к нормальной микрофлоре человека, но также могут присутствовать на слизистых в течение короткого периода времени (транзиторное носительство) без каких-либо серьезных последствий для здорового человека. С другой стороны, обнаружение грибов в стерильных средах (кровь, образец ткани), особенно у пациента с иммуносупрессией, – это всегда патологический признак, который указывает на наличие инвазивного микоза.

Бактериологический метод целесообразно дополнить другими лабораторными исследованиями, в первую очередь гистологическим исследованием.

Для чего используется исследование?

  • Для диагностики инвазивных микозов.

Когда назначается исследование?

  • При наличии у пациента факторов риска инвазивной грибковой инфекции: онкогематологических заболеваний, лекарственной иммуносупрессии, ВИЧ-инфекции;
  • при наличии клинических или рентгенологических признаков инвазивных грибковых инфекций.

Что означают результаты?

Референсные значения: отрицательно.

Положительный результат:

  • стерильный биоматериал (кровь, образец ткани): инвазивный микоз (кандидоз/криптококкоз/аспергиллез);
  • нестерильный биоматериал (мокрота, мазки, отделяемое): инвазивный микоз или «здоровое носительство».

Отрицательный результат:

  • норма;
  • ложноотрицательный результат.

Что может влиять на результат?

  • Применение антимикотических препаратов (азолы, амфотерицин, эхинокандины) до взятия биоматериала на исследование (может приводить к ложноотрицательному результату);
  • характер биоматериала для исследования (стерильный или нестерильный).

Важные замечания

  • Результат исследования следует интерпретировать с учетом факторов риска, клинических и рентгенологических признаков инвазивного микоза.
  • Отрицательный результат исследования не позволяет исключить инвазивный микоз.

Также рекомендуется

Кто назначает исследование?

Инфекционист, пульмонолог, аллерголог, врач общей практики.

Литература

  • Ellepola AN, Morrison CJ. Laboratory diagnosis of invasive candidiasis. J Microbiol. 2005 Feb;43 Spec No:65-84. Review.
  • GOLDMAN L, AUSIELLO D. Cecil MEDICINE/L. Goldman, D. Ausiello; 23 ed. – Saunder Elsevier, 2007.
  • Fauci et al. Harrison’s PRINCIPLES OF INTERNAL MEDICINE/A. Fauci, D. Kasper, D. Longo, E. Braunwald, S. Hauser, J. L. Jameson, J. Loscalzo; 17 ed. – The McGraw-Hill Companies, 2008.
Оцените статью
Дача-забор
Добавить комментарий