- Бактериологический посев (культуральный метод) | анализы на eurolab
- В каких случаях используют бактериологический метод
- Взятие гноя
- Взятие кала
- Взятие материала из зева
- Взятие мокроты
- Для определения каких микроорганизмов чаще всего проводятся бактериальные посевы
- Забор материала при подозрении протозойных инфекций
- Как проводится выявление микроорганизмов методом посева и для чего нужен этот анализ
- Как происходит взятие материала
- Культивирование
- Микроскопическое исследование
- Недостатки исследований на бактериальный посев
- Показания к проведению посевов на флору и чувствительность к антибиотикам
- Последовательность действий и особенности методики
- Расшифровка результатов
- Сбор материала
- Сколько времени делается анализ, расшифровка
- Собирание мочи
- Техника посевов микроорганизмов на питательные среды — учебнометодическое пособие для проведения лабораторнопрактических…
Бактериологический посев (культуральный метод) | анализы на eurolab
В каких случаях используют бактериологический метод
Исследование проводят для диагностики инфекционных заболеваний с хроническим (реже – острым) течением. Локализация и степень поражения может быть различной. Общие примеры:
- ЗППП и инфекции мочевыделительной системы – хламидиоз, трихомониаз, микоплазмоз и др.;
- кишечные инфекции – дизентерия, брюшной тиф, сальмонеллез;
- хронические поражения органов дыхательной системы – синуситы, тонзиллиты, бронхиты, пневмонии;
- гнойные процессы различной локализации, в том числе гнойничковые поражения кожи. В данном случае определение чувствительности микроорганизма к антибиотикам особенно актуально;
- дисбактериоз слизистых структур – кишечника, половых органов, ротовой полости. Методика позволяет не только выявить патогенных и условно-патогенных возбудителей, но и сделать заключение о составе здоровой микрофлоры;
- сепсис – общее заражение крови.
Взятие гноя
Лучше всего брать гной для посева из закрытого очага посредством пункции или в момент его вскрытия хирургом. Гной собирают в пробирку.
Если гнойник уже вскрыт или имеется гнойная рана, то сначала ватным тампоном следует очистить поверхность и гной брать из глубины, где меньше вторичной микрофлоры. При маленьких гнойничках гной берут ватным тампоном, употребляющимся для взятия материала из зева.
Взятие кала
Для выделения дизентерийных палочек очень хорошо собирать кал через ректоскоп. Это можно сделать с помощью стерильного ватного тампона на длинной проволочке, которым под контролем глаза можно взять непосредственно отделяемое с язвы (комочек гноя или слизи).
Следует отметить, что возбудители кишечных инфекций плохо выдерживают сожительство с другими видами микробов и отмирают в нижних отделах кишечника, поэтому первая порция кала мало пригодна для посева. Особенно неустойчивы дизентерийные палочки. Если кал дизентерийного больного постоит при комнатной температуре 1 – 2 часа, то дизентерийных палочек можно уже не обнаружить.
Поэтому при подозрении на дизентерию кал засевают на питательные среды или непосредственно у постели больного, а если это невозможно, то его сразу же вносят в консервирующую жидкость (30% глицерина в физиологическом растворе), которая не давая размножаться другим микробам, сохраняет жизнеспособность дизентерийных бактерий.
Для выявления бактерионосителей тифо- паратифозных бактерий кал необходимо собирать после приема желчегонного слабительного (30 г сернокислой магнезии или др.). При этом, испражнения берут только из жидкой порции, поступающей из верхних отделов кишечника, куда бактерии поступают из желчного пузыря, являющегося резервуаром тифо- паратифозных бактерий.
Выделение возбудителей сибирской язвы, холеры, чумы и других особо опасных инфекций выполняют в специализированных лабораториях строго режима.
Выделение вирусов, риккетсий и хламидий производят в специализированных лабораториях. Материал в эти лаборатории направляют в хорошо закрытых контейнерах в замороженном состоянии.
Взятие материала из зева
Для посева из зева материал лучше брать утром натощак. Материал берут стерильным ватным тампоном. Язык обязательно придерживают шпателем, так как только немногие больные умеют самостоятельно показывать зев.
Нельзя брать материал «вслепую», а нужно точно, под контролем глаза, взять пленку, гнойную пробку, отделяемо слизи и т.д. Тампон е должен прикасаться к корню языка, где имеется богатая посторонняя микрофлора.
Тампон с материалом следует поместить в пробирку, с консервантом и быстро доставить в лабораторию, чтобы исследуемый материал не высох.
При посеве на дифтерийную палочку содержимое тампона засевают на свернутую кровяную сыворотку, которая должна быть свежей и влажной.
Посев делают путем тщательного втирания материала в поверхность питательной среды при постоянном вращении тампона, чтобы со всей его поверхности микробы попали в посев.
Нарушать целостность поверхности питательной среды нельзя.
Посев ставят в термостат, а использованный тампон сдают в стерилизацию.
Взятие мокроты
Перед взятием мокроты для посева больной должен прополоскать рот стерильным физиологическим раствором или свежепрокипяченной водой для удаления по возможности из ротовой полости остатков пищи и посторонней микрофлоры.
Для анализа мокроту берут в стерильную баночку или чашку и тут же отсылают в лабораторию.
Для посева на туберкулезную палочку мокроту собирают в большом количестве – около четверти баночки для собирания мокроты.
Для определения каких микроорганизмов чаще всего проводятся бактериальные посевы
- Разнообразной кокковой флоры, вызывающей гнойное поражение половых путей, органов дыхания, ЛОР-органов, нагноения ран и язв.
- Дифтерийной палочки – возбудителя опасной болезни – дифтерии, поражающей дыхательные пути, глаза, нос.
- Возбудителей кишечных инфекций – кишечную палочку, дизентерийную группу, брюшнотифозные бактерии, возбудителей паратифа, сальмонеллу, иерсинию.
- Разнообразных микробов, вызывающих урогенитальные патологии и половые инфекции – гонококк, микоплазму, уреаплазму, трихомонаду, грибок молочницы.
- Кроме того, высевают возбудителей, которые могут вызывать различные заболевания – энтеробактерии, гемофильные микроорганизмы, клебсиеллы.
Забор материала при подозрении протозойных инфекций
Правильный метод забора материала имеет большое значение при диагностике протозойных инфекций.
Нельзя вводить лекарственные препараты незадолго до взятия исследуемого материала.
При проведении лабораторных исследований с диагностической целью исследуемый материал отбирается в зависимости от места локализации возбудителя протозойной инфекции.
При выявлении кишечных паразитов испражнения необходимо собирать в чистые, сухие баночки, которые не содержат следов дезинфицирующих веществ или воды, так как и то, и другое действуют губительно на нежные организмы паразитов.
В кроваво – слизистом, слизистом или жидком стуле простейшие, как правило, встречаются только в вегетативной стадии, очень нестойкой во внешней среде. Поэтому такие испражнения необходимо исследовать сразу же, пока не погибли паразиты (возбудители амебиаза, балантидиоза).
Исследованию необходимо подвергать и слизь, так как нередко при отсутствии простейших в испражнениях, их можно в изобилии найти в слизи.
В оформленном стуле почти исключительно встречаются цисты. Хотя цисты устойчивы к воздействию факторов внешней среды, все равно исследование необходимо проводить сразу же, поскольку в структуре цист со временем могут произойти изменения.
Приготовление микропрепаратов необходимо начинать со слизи.
Независимо от состояния материала (кроваво – слизистый, жидкий или густой) мазок должен быть тонким. Для этого материал, пи необходимости, суспендируется в капле физиологического раствора. Делаются два параллельных микропрепарата.
Для первоначальной ориентировки материал, нанесенный на предметное стекло, накрывается покровным и в неокрашенном виде просматривается при помощи микроскопа. Поскольку точное определение паразитов в таких препаратах затруднено, другой микропрепарат окрашивается анилиновым красителем или обрабатывается раствором Люголя.
При просмотре неокрашенных мазков, для сохранения жизнеспособности простейших используются микроскопы со специальными нагревательными столиками (32 – 40 рад.) для предотвращения переохлаждения паразитов.
Необходимо помнить, что при диагностике кишечных протозойных инфекций только шестикратный отрицательный результат исследований можно считать окончательным.
Для обогащения исследуемого материала цистами может быть применен осадочный метод, представляющий собой механический способ обогащения цистами. Он представляет собой последовательное фракционированное отстаивание эмульсии, приготовленной из испражнений, разбавленных в воде.
Для осаждения цист необходимы сутки. В том случае, когда цист в испражнениях бывает очень мало или когда недостаточно исследуемого материала, этот метод не обеспечивает положительного результата. В таком случае применяется биологический метод обогащения.
При проведении исследований с целью обнаружения возбудителей протозойных инфекций в крови, спинномозговой жидкости, тканях (возбудителей малярии, токсоплазмоза, трипаносомоза, висцерального лейшманиоза) забор крови, спинномозговой жидкости, пунктатов костного мозга и лимфатических узлов, биоптатов печени и селезенки необходимо выполнять, соблюдая правила асептики.
Кровь для приготовления микропрепаратов берется из пальца во время приступа лихорадки и готовится препарат по методу «толстой капли». Препараты окрашиваются по методу Романовского – Гимза.
При диагностике лейшманиозов исследуемый материал при необходимости для накопления паразитов засевают на агар с дефибринированной кровью NNN.
При диагностике токсоплазмоза для накопления токсоплазм используют культуры ткани, развивающиеся куриные эмбрионы, лабораторные животные (хомяки, мыши, морские свинки, кроли). Животных заражают в мозг или в брюшную полость.
При протозойных инфекциях у людей обнаруживаютсяв крови:Babesia bovis, B.canis, B.divergenesHaemoproteus columbaeHepatocystis sp.Leishmania donovani, L.infantum, L.chagassiNaegleria gruberiPlasmodium vivax, P.ovale, P.malariae, P.falciparumToxoplasma gondiiTripanosoma brucei, Tr.cruzi, Tr.gambiense, Tr.rangrli, Tr.rhodensiense/
в мокроте:Balantidium coliEntamoeba buccalis, E.gingivalis, E.pulmonalisPneumocystis cariniiTrichomonas buccalis
в выделениях половых органов и моче:Cyclospora cayetanensisTrichomonas vaginalis
в зоне поражения кожи:Leishmania brasiliensis, L.infantum, L.nilotica, L.tropicaSarcocystis bovihominis, S.fusiformis
в испражнениях:Balantidium coliChilomastix mesniiCryptosporidium parvum, Cr.canisDienamoeba fragilisEimeria bovis, E.chipearum, E.sardinae, E.intestinalis, E.wenyoniEndolimax nanaEntamoeba apis, E.coli, E.dispar, E.hartmani, E.
histolytica, E.moschkowskyGiardia agilisIodamoeba ButshliiIsospora belli, I.hominis, I.natalensis, I.intestinalisLamblia intestinalisPentatrichomonas yominisSarcocystis bovihominis, S.fusiformisTrchomonas hominis, Tr.intestinalis
в спинно – мозговой жидкости и в мозгу:Acantamoeba astronyxis, A.culberstoniNaegleria aerrobia, N.gruberi, N.fowleriToxoplasma gondiiTrypanosoma cruzi, Tr.gambiense, Tr. rhodensiense
в дуоденальном содержимом:Lamblia intestinalis
в костном мозгу, лимфатических узлах, печени, селезенке:Acantaoeba astronyxisGiardia agilisLeishmania brassliensis. L.chagasi, L.donovani, L.infantum, L.tropicaNaegleria aerobia, N.fowleriPentatrichomonas hominisToxoplasma gondiiTrichomonas hominisTrypanosoma cruzi, Tr.gambiense, Tr.rhodensiense
в ротовой полости:Entamoeba gingivalisTrychomonas buccalis,Tr. elongate, Tr.tenax, Tr.pulmonalis
Как проводится выявление микроорганизмов методом посева и для чего нужен этот анализ
При инфекционном поражении следует узнать, какой микроб вызвал болезнь и с помощью какого антибиотика от него лучше избавиться. Поэтому нужно, чтобы возбудитель проявил себя, показав слабые стороны.
Для этого берутся образцы крови, мочи, слюны, секрета простаты, семенной жидкости, слизи из уретры и цервикального канала, носоглотки, мокроты, грудного молока, содержимого ран и язв. Материал переносится на питательные среды – специальные смеси, на которых микробы лучше всего растут. Для посева используются плоские чашечки Петри или пробирки.
Затем образец помещают в температурные условия, наиболее благоприятные для микробного роста, и оставляют на определенное время. Через некоторое время на питательных средах начинают появляться микробные колонии – скопления возбудителя, расположенные внутри среды или вовне.
Снаружи разрастаются анаэробные микробы, которым для жизни требуется воздух. Внутри питательной среды развиваются анаэробы – микробы, не любящие воздух и развивающиеся без него.
Из полученных колоний делают мазки, которые рассматривают под микроскопом, чтобы выяснить, какая именно микробная культура высеялась. Делается также вывод об их количестве (обсемененности). Этот показатель важен для дозировки применяемых препаратов. Чем больше обнаружено возбудителей, тем выше будет доза антибактериального средства, назначенного врачом.
Количественный анализ учитывается при выявлении условно-патогенной микрофлоры. Эти микробы и грибки не доставляют проблем, если находятся в организме в ограниченном количестве. Однако превышение норм приводит к болезням, поэтому требует назначения лекарств.
При проведении анализа определяется чувствительность микрофлоры к антибиотикам. Для этого проводится специальный тест, называемый антибиотикограммой.
Патогенные бактерии пересаживают в благоприятную среду и подвергают воздействию различных антибактериальных средств. Для этого в чашку Петри, где находятся колонии микробов, помещают бумажные полоски, смоченные в антибиотике. Через 3-5 дней оценивают результат:
- Микробная гибель на расстоянии 2,5 см от полоски говорит о высокой чувствительности микробов к данному антибактериальному препарату.
- Если все возбудители умерли в радиусе 1,5-2,5 см, чувствительность к антибиотику средняя.
- Если микробы погибли на расстоянии менее 1,5 см от полоски, чувствительность будет слабой. Такой препарат применять нежелательно.
- При отсутствии гибели колоний считается, что данный антибиотик на эту микрофлору не действует.
Степень чувствительности указывается в результатах анализов, чтобы врач потом мог назначить наиболее эффективные препараты.
Анализ желательно проводить всем больным перед началом антибиотикотерапии. Чувствительность к антибактериальным препаратам – индивидуальная характеристика, которая может отличаться у разных больных, даже страдающих одним и тем же заболеванием.
Таким же образом проводится анализ на чувствительность к бактериофагам – специальным вирусам, убивающим определенные виды бактерий.
Микробиологическая диагностика позволяет выбрать из огромного количества выпускаемых препаратов наиболее подходящий и эффективный.
Антибиотикотерапия без проведения анализов может быть абсолютно бесполезной, а иногда и вредной. Микробы, как и любые другие существа, конкурируют друг с другом, поэтому уничтожение одних бактерий всегда вызывает рост других. Если же применять антибиотики без проведения посева, можно убить абсолютно не ту флору, позволив возбудителям инфекции бесконтрольно размножаться.
Как происходит взятие материала
Анализ сдается как минимум через 10 суток после окончания антибиотикотерапии. Перед забором материала нельзя мыть место его взятия гелем или мылом с антибактериальными компонентами.
Процедура зависит от материала, который берется на диагностику:
- Моча собирается утром после подмывания половых органов без использования антибактериального мыла. Образец собирается в чистую емкость в объеме примерно 10-15 мл и сразу доставляется в лабораторию. Образцы, взятые с клеенок и суден, не подходят из-за бактериальной загрязненности.
- Перед взятием мазков из половых путей нельзя спринцеваться, вводить свечи и гели. Материал не собирается во время критических дней.
- Образец на анализ кала берется утром специальной лопаткой в чистую посуду в объеме примерно 30 мг. Нельзя использовать кал, взятый у детей из подгузников, полученный с помощью клизм и слабительных средств.
- Мокроту собирают в специальную чашечку после чистки зубов и полоскания полости рта. Анализ из носоглотки и горла берется медперсоналом клиники.
- Грудное молоко собирают после мытья груди и обработки околососковой зоны спиртом. Первые капли сцеживаются, чтобы промыть молочные протоки, а затем собирается 15 мл в пробирку.
- Мазок из уретры у мужчин берется врачом-урологом. Перед этим в течение 5-6 часов желательно воздержаться от мочеиспускания, иначе урина смоет микробов, и результат будет неточным.
Культивирование
Культивирование проводят с применением механических или биологических методов. Механический подход с использованием стандартных искусственных сред – наиболее распространенный. В данном случае для высевания образцов используют жидкие и твердые питательные составы. Наиболее распространенные – агар, мясо-пептонный бульон.
Посев материала производят с помощью специальной петли или пастеровской пипетки, растирая полученный образец по поверхности или вводя его в толщу питательной среды. Выделение бактерий производят из чистых культур, которые получают повторным посевом ранее выращенных колоний на новую среду.
Биологические методы подразумевают использование специальных питательных сред, которые учитывают особенности микроорганизма, в частности, чувствительность к некоторым химическим веществам, в том числе антибиотикам. В некоторых случаях применяют метод заражения лабораторных животных или тканевых культур с отслеживанием патологических изменений.
Микроскопическое исследование
Основной метод бактериологической диагностики – бактериоскопия. Она подразумевает визуальную оценку параметров микроорганизма под микроскопом. Для этого используют фиксированные и нефиксированные препараты.
Нефиксированные препараты позволяют исследовать живые образцы бактерий. Основные методы:
- раздавленная капля – образец придавливают между предметным и покровным стеклами;
- висячая капля – образец помещают в лунку на предметном стекле и герметично накрывают покровным.В качестве среды используют изотонический раствор или расплавленный агар. Методика позволяет наблюдать за живыми микроорганизмами в течение нескольких дней.
Фиксированные препараты используют для окрашивания с подробным изучением морфологических и некоторых биохимических параметров патогенов. Каплю бактериального состава размазывают по предметному стеклу и фиксируют пламенем горелки или специальными химическими составами.
Для определения свойств бактериальных препаратов используют ряд общих и специфических методик:
- микроскопия – определение формы, размеров, окрашивания по Граму;
- биохимические методы – исследование ферментативной способности микроорганизма к расщеплению тех или иных углеводов, аминокислот, метаболитов, в том числе способность к гемолизу, фибринолизу при попадании в кровь живых существ;
- серологические методы идентификации – реакции агглютинации под воздействием специфической сыворотки и другие антигенные свойства;
- биологические методы – заражение лабораторных ждивотных с проверкой патогенности и токсигенности взятых образцов, их устойчивости к антибиотикам.
Только совокупный анализ результатов всех методов диагностики – микроскопических, биохимических, серологических, биологических – дает объективный результат для вынесения точного диагноза.
Недостатки исследований на бактериальный посев
- Длительное время проведения анализа. Нужно не только выявить возбудителя, но и определить его чувствительность, что занимает много времени. К сожалению, ускорить этот процесс нельзя. Бактерии вырастают в термостате – приборе, поддерживающем нужную температуру, за определённое время. Ускорение приведет к искажению результатов.
- Не все представители микрофлоры высеваются в питательную среду – существуют виды, которые невозможно вырастить в лабораторных условиях.
- Возможность ложноотрицательного результата, который возникает, если пациент перед сдачей материала принимал антибиотики или использовал местные антибактериальные препараты.
Поэтому при сдаче анализов на посев нужно очень аккуратно и точно соблюдать все предписания врача.
Показания к проведению посевов на флору и чувствительность к антибиотикам
- Любые урогенитальные патологии, в том числе ЗППП. Этот метод диагностики особенно рекомендуется при инфекциях, трудно поддающихся лечению.
- Проблемы с кишечником. Анализ высевает все основные кишечные группы и позволяет подобрать не только антибиотики, но и пробиотики.
- Любые гнойные поражения – язвы, раны, лактационный мастит. С помощью посева можно понять, какие микробы вызывали нагноение, и подобрать антибиотик.
- Беременность – в этот период делаются посевы из носоглотки, чтобы выявить микрофлору, опасную для будущего малыша.
- ЛОР-инфекции и поражение дыхательных путей. Проведение бакпосева рекомендуется при затяжных ринитах, фарингитах, частых ангинах. Это позволит выявить микроорганизмы, вызывающие указанные заболевания.
- Анальный зуд – в этом случае нужно сдать посев на грибок молочницы, который часто вызывает такой симптом.
- Обследование детей перед поступлением в дошкольное учреждение и школу, поездкой в детский лагерь или санаторий.
- Профосмотр работников, занятых в пищевой промышленности или работающих с продуктами питания.
Последовательность действий и особенности методики
Для проведения бактериологического исследования необходимо выполнить сбор материала и культивировать его на питательных средах с последующей микроскопией полученных штаммов и проверкой чувствительности к антибиотикам.
Расшифровка результатов
Стандартный результат сводится к двум пунктам анализа:
- качественный анализ с определением факта наличия/отсутствия определенного возбудителя;
- количественный анализ с указанием числа микроорганизмов на единицу объема – выражают в КОЕ (колониеобразующие единицы). Чем выше этот показатель, тем сильнее бактериальное поражение организма данным возбудителем.
Внимание!Отрицательный результат является относительным и показывает отсутствие патогенных организмов лишь в отдельно взятой порции материала. Для большей объективности данных требуется повторное обследование.
Сбор материала
Биоматериалом для исследования могут служить кровь, моча, ликвор, мокрота, сперма, кал, мазки из глотки, влагалища, уретры, любые другие ткани и жидкости из области инфекционного процесса. Образцы собирают в асептических условиях, помещают в стерильную посуду и в течение 2-х часов доставляют в лабораторию. При необходимости пробы хранят при пониженных температурах.
Сколько времени делается анализ, расшифровка
Тем, кто решился на такое обследование, нужно помнить, что быстро такая диагностика не проводится. Минимальный срок, как правило, составляет 3-4 дня, а максимальный – до 10 сут. За это время нужно вырастить возбудителя и определить его чувствительность к антибиотикам.
Количество выявленных микроорганизмов оценивается в КОЕ/мл, где это КОЕ – колониеобразующие единицы. Чем выше этот показатель, тем больше микробов обнаружено. В бланке анализов обязательно указывается чувствительность к наиболее распространенным антибиотикам (высокая, средняя, низкая).
Самостоятельно больному определить, какая именно флора была высеяна, очень сложно. Поэтому с полученным анализом нужно обратиться к урологу, гинекологу, маммологу, который проведет расшифровку результатов.
Это несложное исследование позволит выявить и вылечить самые различные инфекции – от простых до достаточно сложных. Антибиотики и другие антибактериальные препараты, назначенные по результатам анализов, действительно пойдут на пользу.
Собирание мочи
Для посева желательно брать утреннюю мочу. Мочу берут катетером в стерильную пробирку или флакон. Для предварительной дезинфекции наружного отверстия уретры лучше всего пользоваться раствором оксицианистой или цианистой ртути (1 : 1000).
Только в исключительных случаях, когда катетеризация нежелательна, можно взять мочу без катетера, после предварительного тщательного туалета половых органов, спустив первую порцию мочи, чтобы она смыла микробов из уретры. Однако в этих случаях, особенно у женщин, никогда не может быть уверенности в том, что в посев не попадут микробы из наружных половых органов или из ануса.
Мочу для посева обычно собирают в количестве 10 – 12 мл, но если мочу берут раздельно из правой и левой почки, то приходится удовлетвориться меньшим ее количеством.
Для посева на туберкулезную палочку берут около 200 мл утренней мочи.
До отправления мочи в лабораторию ее хранят на холоду, чтобы задержать размножение повторной микрофлоры.
Взятие дуоденального содержимого
Дуоденальное содержимое получают с помощью предварительно прокипяченного дуоденального зонда.
Для микробиологического исследования наибольшее значение имеет пузырная желчь – порция В и порция С, выделяемая из печеночных ходов.
Чтобы предохранить дуоденальное содержимое от загрязнения посторонней микрофлорой, в наружный конец зонда вставляют стеклянную трубочку, на которую надевают резиновую трубку.
Когда начнет выделяться нужная порция жидкости, резиновую трубку сбрасывают, а стеклянную трубку обжигают на огне и через нее собирают дуоденальное содержимое.
Техника посевов микроорганизмов на питательные среды — учебнометодическое пособие для проведения лабораторнопрактических…
Подборка по базе: Свердлов 2023 Конструирование компиляторов Учебное пособие Есть , Учебное пособие_2020_целиком.pdf, 3 Махмутова Методическое пособие.doc, Особенности боевых действий по тушению пожаров и проведения АСР, УМТБ пособие.docx, _технология проведения и оформления инвентаризации.docx, Алгоритм проведения очередного собрания первичного отделения для, Эндодонтия пособие 2023.PDF, 8 Профконсультация как вид профорентационной работы психолога. П, Методическое пособие 7 кл.docx
Для работы с микроорганизмами используют специальные бактериологические петли, иглы, шпатели, пипетки. Посевы всегда проводят около пламени горелки. Около работающего с чистой культурой нельзя делать резких движений, ходить, кашлять и т.п., так как движение воздуха увеличивает опасность попадания посторонних микроорганизмов в пробирку с культурой. Поэтому посевы и пересевы микроорганизмов рекомендуется проводить в боксе.
Рис. 19.Правила разливания питательной среды в чашки Петри
Посев в жидкую питательную среду. Посев производят петлей или градуированной пипеткой. Посевной материал бактериологической петлей осторожно вносят в пробирку и легко встряхивают в верхнем слое питательной среды или растирают по стенке, смывая его жидкой средой.
Стерильную пипетку фламбируют (обжигают) в пламени горелки, опускают в пробирку с культурой, отбирают определенное количество материала и переносят его в пробирку со свежей питательной средой, выпуская жидкость по стенке пробирки, или вносят пипетку вглубь среды и выдувают содержащийся в ней материал.
Посев штрихом в пробирку со скошенным агаром (рис.22). Пробирку с культурой и пробирку со скошенным питательным агаром берут в левую руку и держат в наклонном положении. В правую руку берут бактериологическую иглу и прокаливают ее в пламени спиртовки до покраснения, затем проносят сквозь пламя иглодержатель. Мизинцем правой руки вынимают пробки из обеих пробирок, обжигают края пробирок. Петлю вводят в пробирку с культурой, охлаждают ее о края пробирки и осторожно снимают небольшое количество микробной культуры. Петлю с посевным материалом быстро переносят в пробирку со стерильной средой и опускают почти до дна, где скапливается небольшое количество конденсационной влаги. Слегка касаясь агара, проводят зигзагообразную линию, при этом петлю не отрывают от поверхности питательной среды. После посева петлю вынимают из пробирки и обжигают вместе с остатками посевного материала.
Затем обжигают края пробирок и внутренние концы пробок, после чего пробирки закрывают. На наружной поверхности пробирки пишут дату посева и наименование культуры.
Рис. 20.Посев микроорганизмов «штрихом» на скошенный агар
Посев уколом (рис.21). Профламбированной бактериологической иглой берут исследуемую культуру. Пробирку со столбиком питательной среды берут в правую руку, переворачивают вверх дном, вынимают из нее пробку, прижимая ее мизинцем к ладони. Подняв пробирку на уровень глаз, в центре столбика прокалывают плотную среду иглой снизу вверх на всю глубину. Затем иглу извлекают и обжигают вместе с остатками посевного материала, пробирку закрывают пробкой, подписывают и помещают в термостат для выращивания.
Рис. 21. Посев уколом на плотную питательную среду
Рис.22. Пересев культуры микроорганизмов в пробирки
Посев на поверхность среды в чашку Петри (рис.23). В чашки Петри заливают расплавленный агар, дают ему застыть и подсушивают в термостате. Посев проводят бактериологической петлей или шпателем Дригальского (стеклянная палочка, согнутая в виде треугольника). При использовании петли посев осуществляют штриховым методом. Крышку чашки Петри слегка приоткрывают настолько, чтобы в образующуюся щель проходила петля. Петлю кладут плашмя на питательную среду, чтобы не поцарапать ее, и наносят микробную культуру зигзагообразными движениями (штрихом) по всей поверхности агара, не отрывая от среды, что дает возможность получить изолированные колонии. 
Рис. 23. Посев на плотную питательную среду в чашки Петри
Посевы «газоном» производят шпателем. Для этого, приоткрыв левой рукой крышку чашки Петри, петлей или пипеткой наносят посевной материал на поверхность питательного агара. Затем проводят шпатель сквозь пламя горелки, остужают его о внутреннюю сторону крышки и растирают материал по всей поверхности среды. После посева шпатель вынимают и обжигают вместе с остатками посевного материала. После инкубации посевов в чашке появляется равномерный газон выросшей культуры.
Рис. 24. Посев на агар в чашки Петри шпателем Дригальского
Глубинный посев в чашку Петри. Определенное количество подготовленного к посеву исследуемого материала (1,0или 0,1 см3) вносят пипеткой в пустую чашку Петри. Из пробирки или колбы с расплавленной и остуженной до 45 °С питательной средой вынимают пробку, обжигают края в пламени горелки и, слегка приоткрыв крышку, выливают на дно чашки.
Пробирки и чашки с посевами помещают в термостат с температурой, оптимальной для конкретного микроорганизма. Как правило, мезофильные бактерии выращивают при температуре 37±1 °С, термофильные бактерии – при 40–55 °С, дрожжи и плесени – при 30±1 °С.
Культивирование и рост микроорганизмов
Выращивание микроорганизмов на питательных средах называется культивированием, а развившиеся в таких средах микроорганизмы – культурой. При культивировании происходит рост культуры – физиологический процесс, в результате которого увеличивается биомасса – масса клеточного вещества данного микроорганизма.
Чистой культурой микроорганизма называют культуру, которая представлена потомством одной клетки. Естественным путем получить чистую культуру почти невозможно, поэтому ее получают искусственно. Для выделения чистой культуры используют плотные питательные среды, на которых каждая клетка вырастает в виде изолированной колонии – популяции микроорганизмов одного вида.
Перед выделением чистой культуры из какого-либо пищевого продукта или природного субстрата (например: почвы, воды), в котором данный микроорганизм находится в небольших количествах, вначале получают накопительные культуры, проводя культивирование в элективных условиях.
Накопительные культуры состоят преимущественно из клеток микроорганизмов одного вида. Элективные (накопительные) условия – условия, способствующие развитию одной культуры и ограничивающие развитие сопутствующих микроорганизмов. Создать накопительные условия можно путем использования накопительных сред. Примером элективных условий может быть повышенная температура (для выделения термоустойчивых форм бактерий), повышенная кислотность, повышенная концентрация соли и т.д.
Инкубация – культивирование микроорганизмов при определенной температуре.
Хранят чистые культуры обычно на плотных питательных средах в пробирках. При этом постоянно необходимо делать пересевы на свежую питательную среду.
К другим способам хранения чистых культур относятся сохранение их на накопительной среде под слоем вазелинового масла и хранение в лиофилизованном состоянии (сушка под вакуумом замороженных клеток микроорганизмов).
В пищевой промышленности применяют чистые культуры дрожжей, молочнокислых, уксуснокислых, пропионовокислых бактерий, обладающих ценными свойствами для производства. В последнее время находят успешное применение многокомпонентные чистые культуры, состоящие из двух и более видов микроорганизмов.
Работа по получению и поддержанию чистых культур промышленных микроорганизмов осуществляется в научно-исследовательских лабораториях. Там они выделяются из различных субстратов, изучаются, и наиболее продуктивные, пригодные для производства, хранятся в коллекции музея чистых культур, откуда рассылаются отраслевыми научно-исследовательскими институтами на предприятия. В заводской лаборатории микробиолог подготавливает культуру для производственного цикла, проверяет ее биологическую чистоту, активность.
Способ культивирования зависит от конечной цели культивирования (целью является либо накопление биомассы, либо получение определенного продукта жизнедеятельности – метаболита).
Поверхностное культивирование заключается в выращивании аэробных микроорганизмов на поверхности жидких и сыпучих питательных сред. При этом микроорганизмы получают кислород непосредственно из воздуха. При поверхностном культивировании на жидких средах микроорганизмы растут в виде пленок. Осуществляется поверхностное культивирование в специальных ваннах – кюветах.
Глубинное культивированиепроводится на жидких питательных средах, в которых микроорганизмы развиваются во всем объеме питательной среды. Сочетание питательной среды и растущих в ней микроорганизмов называют культуральной жидкостью. Осуществляется глубинное культивирование в специальных аппаратах – ферментаторах, снабженных мешалками и системой подвода стерильного воздуха для обеспечения роста аэробных микроорганизмов. Аэрирование – продувание стерильного воздуха через культуральную жидкость.
При периодическом культивировании весь объем питательной среды засевают чистой культурой, которую выращивают в оптимальных условиях определенный период времени до накопления нужного количества целевого продукта. Следует отметить, что, так как культивирование ведется на невозобновляемой питательной среде (в стационарных условиях), то клетки все время находятся в меняющихся условиях. Таким образом, периодическую систему можно рассматривать как замкнутую систему.
При непрерывном культивировании культура находится в специальном аппарате, куда постоянно притекает питательная среда и откуда с такой же скоростью отводится культуральная жидкость. Для микроорганизма создаются неизменные условия среды, поэтому непрерывную систему можно рассматривать как открытую систему.
Поверхностное культивирование может быть только периодическим, в то время как глубинное культивирование может осуществляться и периодическим, и непрерывным способом.
При периодическом способе культивирования популяция микроорганизмов проходит 7 стадий (фаз) роста (рис. 25).
lgN
1 2 3 4 5 6 7
Рис. 25 Кривая роста статической культуры:
N – концентрация жизнеспособных клеток;
τ – продолжительность культивирования
1. Лагфаза. В этот период культура адаптируется к новой среде обитания. Активизируются ферментные системы, возрастает количество нуклеиновых кислот, клетка готовится к интенсивному синтезу белков и других соединений. Клетки не размножаются (скорость размножения равна нулю). Концентрация живых клеток постоянна и равна количеству внесенных клеток. Продолжительность этой фазы зависит от физиологических особенностей микроорганизма и от состава питательной среды.
2. Фаза ускорения роста. Эта фаза характеризуется началом деления клеток, увеличением общей массы и постоянным увеличением скорости роста культуры. Эта фаза обычно непродолжительна.
3. Экспоненциальная (логарифмическая) фаза роста. В этот период микроорганизмы размножаются с постоянной максимальной скоростью. При этом логарифм числа клеток линейно зависит от времени. К концу этой фазы среда истощается вследствие катаболических и анаболических процессов, в среде накапливаются продукты жизнедеятельности микроорганизмов. Возникает и пространственная ограниченность, так как клетки мешают друг другу.
4. Фаза замедления роста. В этот период снижается скорость роста, небольшая часть клеток гибнет. Скорость роста выше скорости отмирания.
5. Стационарная фаза. Количество живых клеток достигает максимума. Скорость роста равна скорости отмирания клеток, поэтому концентрация жизнеспособных клеток остается постоянной.
6. Фаза ускорения отмирания. Количество отмерших клеток (скорость отмирания) становится больше количества образовавшихся клеток.
7. Фаза отмирания. Масса живых клеток значительно уменьшается, так как в среде нет питательных веществ, а запасные вещества клетки исчерпываются.
При непрерывном способе культивирования культура поддерживается в какой-то фазе роста.
Если цель культивирования – получение биомассы продуцента, процесс целесообразно вести в режиме логарифмической фазы, когда микроорганизм способен обеспечить максимальную скорость роста популяции.
Для поддержания культуры в логарифмической фазе культивирование микробной популяции проводят в условиях хемостата или турбидостата.
Рост в хемостате. Хемостат состоит из сосуда, в который вводят с постоянной скоростью питательный раствор. По мере поступления питательного раствора из него вытекает суспензия микроорганизмов с той же скоростью. При культивировании в условиях хемостата поддерживается постоянная концентрация одного из компонентов среды (например, углерода). Благодаря этому в условиях хемостата поддерживается постоянная скорость роста культуры. Культура микроорганизма находится в условиях динамического равновесия.
Рост в турбидостате. Работа турбидостата основана на поддержании постоянной концентрации живых клеток. В сосуде для культивирования все питательные вещества содержатся в избытке, а скорость роста бактерий приближается к максимальной.
Если же целью культивирования является получение метаболита (например, этилового спирта), выход которого в среду обитания не соответствует логарифмической фазе роста, применяется способ непрерывного выращивания в двух или нескольких последовательно соединенных аппаратах, что позволяет как бы расчленить процесс на несколько стадий.